Beruf Molekularbiologe. Angewandte Molekularbiologie. A). Hauptliteratur

1. Einleitung.

Gegenstand, Aufgaben und Methoden der Molekularbiologie und Genetik. Bedeutung der „klassischen“ Genetik und der Genetik von Mikroorganismen für die Entwicklung der Molekularbiologie und Gentechnik. Das Konzept eines Gens in der „klassischen“ und molekularen Genetik, seine Evolution. Beitrag der gentechnischen Methodik zur Entwicklung der Molekulargenetik. Angewandter Wert der Gentechnik für die Biotechnologie.

2. Molekulare Grundlagen der Vererbung.

Das Konzept einer Zelle, ihre makromolekulare Zusammensetzung. Die Beschaffenheit des genetischen Materials. Geschichte der Beweise für die genetische Funktion der DNA.

2.1. Verschiedene Arten von Nukleinsäuren. Biologische Funktionen von Nukleinsäuren. Chemische Struktur, räumliche Struktur und physikalische Eigenschaften Nukleinsäuren. Strukturmerkmale des genetischen Materials von Pro- und Eukaryoten. Komplementäre Watson-Crick-Basenpaare. Genetischer Code. Die Geschichte der Entschlüsselung des genetischen Codes. Die Haupteigenschaften des Codes: Triplett, Code ohne Kommas, Entartung. Merkmale des Codewörterbuchs, Codonfamilien, semantische und „bedeutungslose“ Codons. Zirkuläre DNA-Moleküle und das Konzept der DNA-Supercoiling. Topoisomere der DNA und ihre Typen. Wirkmechanismen von Topoisomerasen. Bakterielle DNA-Gyrase.

2.2. DNA-Transkription. Prokaryotische RNA-Polymerase, ihre Untereinheit und dreidimensionale Strukturen. Vielzahl von Sigma-Faktoren. Prokaryontischer Genpromotor, seine Strukturelemente. Phasen des Transkriptionszyklus. Initiierung, Bildung eines „offenen Komplexes“, Verlängerung und Beendigung der Transkription. Transkriptionsabschwächung. Regulierung der Tryptophan-Operon-Expression. „Riboschalter“. Mechanismen der Transkriptionstermination. Negative und positive Regulierung der Transkription. Lactose-Operon. Transkriptionsregulation bei der Entwicklung von Lambda-Phagen. Prinzipien der DNA-Erkennung durch regulatorische Proteine ​​(CAP-Protein und Lambda-Phagenrepressor). Merkmale der Transkription in Eukaryoten. RNA-Verarbeitung in Eukaryoten. Capping, Spleißen und Polyadenylierung von Transkripten. Spleißmechanismen. Die Rolle kleiner nuklearer RNA- und Proteinfaktoren. Alternatives Spleißen, Beispiele.

2.3. Übertragen, seine Stadien, die Funktion der Ribosomen. Lage der Ribosomen in der Zelle. Prokaryotische und eukaryotische Ribosomentypen; 70S- und 80S-Ribosomen. Morphologie von Ribosomen. Aufteilung in Unterteilchen (Untereinheiten). Codon-abhängige Bindung von Aminoacyl-tRNA im Elongationszyklus. Codon-Anticodon-Interaktion. Beteiligung des Elongationsfaktors EF1 (EF-Tu) an der Bindung von Aminoacyl-tRNA an das Ribosom. Elongationsfaktor EF1B (EF-Ts), seine Funktion, Reaktionsablauf mit seiner Beteiligung. Antibiotika, die das Stadium der codonabhängigen Bindung von Aminoacyl-tRNA an das Ribosom beeinflussen. Aminoglykosid-Antibiotika (Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, Gentamicin usw.), ihr Wirkmechanismus. Tetracycline als Inhibitoren der Aminoacyl-tRNA-Bindung an das Ribosom. Sendeinitiierung. Die Hauptphasen des Initiationsprozesses. Translationsinitiierung in Prokaryoten: Initiationsfaktoren, Initiatorcodons, RNA-3¢-Ende der kleinen ribosomalen Untereinheit und die Shine-Dalgarno-Sequenz in mRNA. Translationsinitiation in Eukaryoten: Initiationsfaktoren, Initiatorcodons, 5¢-untranslatierte Region und cap-abhängige terminale Initiation. „Interne“ cap-unabhängige Initiation bei Eukaryoten. Transpeptidierung. Transpeptidierungsinhibitoren: Chloramphenicol, Lincomycin, Amicetin, Streptogramine, Anisomycin. Translokation. Beteiligung des Elongationsfaktors EF2 (EF-G) und GTP. Translokationsinhibitoren: Fusidinsäure, Viomycin, ihre Wirkmechanismen. Übersetzungsbeendigung. Terminationscodons. Proteinterminationsfaktoren von Prokaryoten und Eukaryoten; zwei Klassen von Terminationsfaktoren und Mechanismen ihrer Wirkung. Regulierung der Übersetzung in Prokaryoten.

2.4. DNA Replikation und seine genetische Kontrolle. An der Replikation beteiligte Polymerasen, Merkmale ihrer enzymatischen Aktivitäten. DNA-Treue. Die Rolle sterischer Wechselwirkungen zwischen DNA-Basenpaaren während der Replikation. E. coli-Polymerasen I, II und III. Untereinheiten der Polymerase III. Replikationszweig, „führende“ und „nacheilende“ Threads während der Replikation. Fragmente des Okazaki. Komplex von Proteinen in der Replikationsgabel. Regulierung der Replikationsinitiierung in E. coli. Beendigung der Replikation bei Bakterien. Merkmale der Regulierung der Plasmidreplikation. Bidirektionale und Rolling-Ring-Replikation.

2.5. Rekombination, seine Typen und Modelle. Allgemeine oder homologe Rekombination. Doppelstrangbrüche in der DNA, die die Rekombination einleiten. Die Rolle der Rekombination bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen nach der Replikation. Holliday-Struktur im Rekombinationsmodell. Enzymologie der allgemeinen Rekombination in E. coli. RecBCD-Komplex. Reca-Protein. Die Rolle der Rekombination bei der Sicherstellung der DNA-Synthese bei DNA-Schäden, die die Replikation unterbrechen. Rekombination in Eukaryoten. Rekombinationsenzyme in Eukaryoten. Ortsspezifische Rekombination. Unterschiede in den molekularen Mechanismen der allgemeinen und ortsspezifischen Rekombination. Klassifizierung von Rekombinasen. Arten von Chromosomenumlagerungen, die während der ortsspezifischen Rekombination durchgeführt werden. Regulatorische Rolle der ortsspezifischen Rekombination in Bakterien. Konstruktion mehrzelliger eukaryotischer Chromosomen mithilfe des ortsspezifischen Phagenrekombinationssystems.

2.6. DNA-Reparatur. Klassifizierung der Wiedergutmachungsarten. Direkte Reparatur von Thymin-Dimeren und methyliertem Guanin. Sockel ausschneiden. Glykosylasen. Der Mechanismus der Reparatur ungepaarter Nukleotide (Mismatch-Reparatur). Auswahl des zu reparierenden DNA-Strangs. SOS-Reparatur. Eigenschaften von DNA-Polymerasen, die an der SOS-Reparatur in Prokaryoten und Eukaryoten beteiligt sind. Das Konzept der „adaptiven Mutationen“ bei Bakterien. Reparatur von Doppelstrangbrüchen: homologe postreplikative Rekombination und Assoziation nicht homologer Enden des DNA-Moleküls. Die Beziehung zwischen den Prozessen der Replikation, Rekombination und Reparatur.

3. Mutationsprozess.

Die Rolle biochemischer Mutanten bei der Bildung der Theorie eines Gens – eines Enzyms. Mutationsklassifizierung. Punktmutationen und chromosomale Umlagerungen, der Mechanismus ihrer Entstehung. Spontane und induzierte Mutagenese. Klassifizierung von Mutagenen. Molekularer Mechanismus der Mutagenese. Zusammenhang zwischen Mutagenese und Reparatur. Identifizierung und Auswahl von Mutanten. Unterdrückung: intragenisch, intergenisch und phänotypisch.

4. Extrachromosomale genetische Elemente.

Plasmide, ihre Struktur und Klassifizierung. Sexualfaktor F, seine Struktur und sein Lebenszyklus. Die Rolle von Faktor F bei der Mobilisierung des Chromosomentransfers. Bildung von Hfr- und F-Donoren. Konjugationsmechanismus. Bakteriophagen, ihre Struktur und ihr Lebenszyklus. Virulente und gemäßigte Bakteriophagen. Lysogenese und Transduktion. Allgemeine und spezifische Transduktion. Migrierende genetische Elemente: Transposons und IS-Sequenzen, ihre Rolle im genetischen Stoffwechsel. DNA - Transposons in den Genomen von Prokaryoten und Eukaryoten IS-Sequenzen von Bakterien, ihre Struktur IS-Sequenzen als Bestandteil des F-Faktors von Bakterien, der die Fähigkeit bestimmt, genetisches Material während der Konjugation zu übertragen Transposons von Bakterien und eukaryotischen Organismen Direkt nicht replizierend und replikative Mechanismen von Transpositionen Das Konzept des horizontalen Transposontransfers und ihre Rolle bei strukturellen Umlagerungen (ektopische Rekombination) und in der Genomentwicklung.

5. Untersuchung der Struktur und Funktion des Gens.

Elemente der genetischen Analyse. Cis-trans-Komplementationstest. Genetische Kartierung mittels Konjugation, Transduktion und Transformation. Erstellung genetischer Karten. Feine genetische Kartierung. Physikalische Analyse der Genstruktur. Heteroduplex-Analyse. Restriktionsanalyse. Sequenzierungsmethoden. Polymerase Kettenreaktion. Aufdecken der Funktion eines Gens.

6. Regulierung der Genexpression. Konzepte von Operon und Regulon. Kontrolle auf der Ebene der Transkriptionsinitiierung. Promotor-, Operator- und regulatorische Proteine. Positive und negative Kontrolle der Genexpression. Kontrolle auf der Ebene der Transkriptionstermination. Katabolit-kontrollierte Operons: Modelle von Lactose-, Galactose-, Arabinose- und Maltose-Operons. Abschwächergesteuerte Operons: ein Modell des Tryptophan-Operons. Multivalente Regulierung der Genexpression. Globale Regulierungssysteme. Regulatorische Reaktion auf Stress. Posttranskriptionelle Kontrolle. Signaltransduktion. RNA-vermittelte Regulation: kleine RNAs, Sensor-RNAs.

7. Grundlagen der Gentechnik. Restriktionsenzyme und Modifikationen. Isolierung und Klonen von Genen. Vektoren für das molekulare Klonen. Prinzipien der Konstruktion rekombinanter DNA und ihrer Einführung in Empfängerzellen. Angewandte Aspekte der Gentechnik.

A). Hauptliteratur:

1. Watson J., Tooze J., Rekombinante DNA: Ein kurzer Kurs. – M.: Mir, 1986.

2. Gene. – M.: Mir. 1987.

3. Molekularbiologie: Struktur und Biosynthese von Nukleinsäuren. / Ed. . - M. Höhere Schule. 1990.

4., - Molekulare Biotechnologie. M. 2002.

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4. Moderne Mikrobiologie. Prokaryoten (in 2 Bänden). – M.: Mir, 2005.

5. M. Singer, P. Berg. Gene und Genome. – M.: Mir, 1998.

6. Schtschelkunow-Ingenieurwesen. - Nowosibirsk: Von Sib. Univ., 2004.

7. Stepanov-Biologie. Struktur und Funktionen von Proteinen. - M.: V. Sh., 1996.

Die Entwicklung der Biochemie, Biophysik, Genetik, Zytochemie und vieler Bereiche der Mikrobiologie und Virologie zu Beginn der 40er Jahre des 20. Jahrhunderts. eng mit der Untersuchung von Lebensphänomenen auf molekularer Ebene verbunden. Die von diesen Wissenschaften gleichzeitig und von verschiedenen Seiten erzielten Erfolge führten zu der Erkenntnis, dass die Hauptkontrollsysteme des Körpers auf molekularer Ebene funktionieren und dass der weitere Fortschritt dieser Wissenschaften von der Offenlegung dieser Wissenschaften abhängen wird die biologischen Funktionen der Moleküle, aus denen die Körper von Organismen bestehen, ihre Beteiligung an der Synthese und dem Zerfall, der gegenseitigen Umwandlung und Reproduktion von Verbindungen in der Zelle sowie der dabei stattfindende Energie- und Informationsaustausch. So entstand an der Schnittstelle dieser biologischen Disziplinen mit Chemie und Physik ein völlig neuer Zweig – die Molekularbiologie.

Im Gegensatz zur Biochemie konzentriert sich die Aufmerksamkeit der modernen Molekularbiologie hauptsächlich auf die Untersuchung der Struktur und Funktion der wichtigsten Klassen von Biopolymeren – Proteine ​​und Nukleinsäuren, von denen die erste die Möglichkeit von Stoffwechselreaktionen bestimmt und die zweite die Biosynthese spezifischer Proteine. Es ist daher klar, dass es unmöglich ist, eine klare Unterscheidung zwischen Molekularbiologie und Biochemie, den entsprechenden Zweigen der Genetik, Mikrobiologie und Virologie, zu treffen.

Die Entstehung der Molekularbiologie war eng mit der Entwicklung neuer Forschungsmethoden verbunden, die bereits in den entsprechenden Kapiteln diskutiert wurden. Neben der Entwicklung der Elektronenmikroskopie und anderer Methoden der Mikroskopietechnik spielten die in den 1950er Jahren entwickelten Methoden zur Fraktionierung zellulärer Elemente eine wichtige Rolle. Sie basierten auf verbesserten Methoden der Differentialzentrifugation (A. Claude, 1954). Zu diesem Zeitpunkt gab es bereits recht zuverlässige Methoden zur Isolierung und Fraktionierung von Biopolymeren. Dazu gehört insbesondere der von A. Tiselius (1937; Nobelpreis, 1948) die Methode der Proteinfraktionierung mittels Elektrophorese, Methoden zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky usw.). Gleichzeitig wurden in vielen Labors der Welt verschiedene Methoden der chromatographischen Analyse entwickelt (A. Martin und R. Sing, 1941; Nobelpreis, 1952), die anschließend erheblich verbessert wurden.

Die Röntgenbeugungsanalyse leistete einen unschätzbaren Beitrag zur Entschlüsselung der Struktur von Biopolymeren. Die Grundprinzipien der Röntgenbeugungsanalyse wurden am King's College der London University unter der Leitung von W. Bragg von einer Forschergruppe entwickelt, zu der J. Bernal, A. Londsdale, W. Astbury, J. Robertson und andere gehörten.

Besonders hervorzuheben sind die Studien zur Protoplasma-Biochemie (1925 - 1929), Professor an der Moskauer Staatsuniversität A. R. Kizel, die für die spätere Entwicklung der Molekularbiologie von großer Bedeutung waren. Kizel versetzte der tief verwurzelten Vorstellung einen Schlag, dass jedes Protoplasma auf einem speziellen Proteinkörper – Platten – basiert, der angeblich alle seine wichtigsten strukturellen und funktionellen Merkmale bestimmt. Er zeigte, dass Platten ein Protein sind, das nur in Myxomyceten und dann in einem bestimmten Entwicklungsstadium vorkommt, und dass im Protoplasma kein dauerhafter Bestandteil – ein einzelnes Skelettprotein – existiert. Damit hat die Untersuchung des Problems der Struktur des Protoplasmas und der funktionellen Rolle von Proteinen den richtigen Weg eingeschlagen und Raum für ihre Entwicklung erhalten. Kisels Forschung hat weltweite Anerkennung gefunden und das Studium der Chemie der Bestandteile der Zelle angeregt.

Der Begriff „Molekularbiologie“, der erstmals vom englischen Kristallographen Professor der Universität Leeds W. Astbury verwendet wurde, tauchte wahrscheinlich in den frühen 1940er Jahren (vor 1945) auf. Die grundlegenden Röntgenbeugungsstudien von Proteinen und DNA, die Astbury in den 1930er Jahren durchführte, dienten als Grundlage für die anschließende erfolgreiche Entschlüsselung der Sekundärstruktur dieser Biopolymere. Im Jahr 1963 schrieb J. Bernal: „Ein Denkmal für ihn wird die gesamte Molekularbiologie setzen – die Wissenschaft, die er benannt und wirklich begründet hat.“ * In der Literatur tauchte dieser Begriff möglicherweise erstmals 1946 auf im Artikel von W. Astbury „Progress of X-ray diffraction Analysis of Organic and Fibrillar Compounds“, veröffentlicht in der englischen Fachzeitschrift „Nature“** . In seiner Harvey-Vorlesung bemerkte Astbury (1950): „Ich freue mich, dass der Begriff Molekularbiologie mittlerweile ziemlich weit verbreitet ist, obwohl es unwahrscheinlich ist, dass ich der Erste war, der ihn vorgeschlagen hat. Er gefiel mir und ich habe lange versucht, ihn zu verbreiten.“ ” ***. Bereits 1950 war Astbury klar, dass sich die Molekularbiologie vor allem mit der Struktur und Konformation von Makromolekülen befasst, deren Untersuchung für das Verständnis der Funktionsweise lebender Organismen von entscheidender Bedeutung ist.

* (Biogr. Mem. Kollegen Roy. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (W. T. Astbury. Fortschritte der Röntgenanalyse organischer und Faserstrukturen.- Natur,. 1946, v. 157, 121.)

*** (W. T. Astbury. Abenteuer in der Molekularbiologie. Thomas Springfield, 1952, S. 3.)

Die Molekularbiologie stand und steht tatsächlich vor den gleichen Aufgaben wie die Biologie insgesamt – der Erkenntnis des Wesens des Lebens und insbesondere seiner Grundphänomene wie Vererbung und Variabilität. Die moderne Molekularbiologie zielt in erster Linie darauf ab, die Struktur und Funktion von Genen sowie die Wege und Mechanismen der Umsetzung der genetischen Information von Organismen in verschiedenen Stadien der Ontogenese und in verschiedenen Stadien ihrer Lesart zu entschlüsseln. Ziel ist es, die subtilen Mechanismen der Regulierung der Genaktivität und Zelldifferenzierung aufzudecken, die Natur der Mutagenese und die molekularen Grundlagen des Evolutionsprozesses aufzuklären.

Feststellung der genetischen Rolle von Nukleinsäuren

Für die Entwicklung der Molekularbiologie waren folgende Entdeckungen von größter Bedeutung. Im Jahr 1944 zeigten die amerikanischen Forscher O. Avery, K. McLeod (Nobelpreis 1923) und M. McCarthy, dass aus Pneumokokken isolierte DNA-Moleküle transformierende Aktivität aufweisen. Nach der Hydrolyse dieser DNAs durch Desoxyribonuklease verschwand ihre transformierende Aktivität vollständig. Damit wurde erstmals überzeugend bewiesen, dass es die DNA und nicht das Protein ist, die in einer Zelle mit genetischen Funktionen ausgestattet ist.

Fairerweise muss angemerkt werden, dass das Phänomen der bakteriellen Transformation viel früher entdeckt wurde als die Entdeckung von Avery, McLeod und McCarthy. Im Jahr 1928 veröffentlichte F. Griffith einen Artikel, in dem er berichtete, dass nach Zugabe abgetöteter Zellen eines eingekapselten virulenten Stamms zu nicht virulenten (nicht eingekapselten) Pneumokokken das resultierende Zellgemisch für Mäuse tödlich wird. Darüber hinaus waren lebende Pneumokokkenzellen, die aus mit dieser Mischung infizierten Tieren isoliert wurden, bereits virulent und besaßen eine Polysaccharidkapsel. So wurde in diesem Experiment gezeigt, dass sich unter dem Einfluss einiger Bestandteile der abgetöteten Pneumokokkenzellen die nicht eingekapselte Form der Bakterien in eine kapselbildende virulente Form verwandelt. Sechzehn Jahre später ersetzten Avery, McLeod und McCarthy in diesem Experiment abgetötete ganze Pneumokokkenzellen durch ihre Desoxyribonukleinsäure und zeigten, dass es sich um DNA handelte, die transformierende Aktivität aufwies (siehe auch Kapitel 7 und 25). Die Bedeutung dieser Entdeckung kann kaum überschätzt werden. Es stimulierte die Untersuchung von Nukleinsäuren in vielen Labors auf der ganzen Welt und zwang Wissenschaftler, sich auf DNA zu konzentrieren.

Mit der Entdeckung von Avery, McLeod und McCarthy häuften sich Anfang der 1950er Jahre bereits zahlreiche direkte und indirekte Beweise dafür, dass Nukleinsäuren eine herausragende Rolle im Leben spielen und eine genetische Funktion haben. Dies wurde insbesondere durch die Art der DNA-Lokalisierung in der Zelle und die Daten von R. Vendrelli (1948) angezeigt, dass der DNA-Gehalt pro Zelle streng konstant ist und mit dem Grad der Ploidie korreliert: In haploiden Keimzellen ist DNA vorhanden halb so viel wie in diploiden Körperzellen. Auch die ausgeprägte metabolische Stabilität der DNA zeugte für die genetische Rolle der DNA. Zu Beginn der 1950er Jahre hatten sich viele verschiedene Fakten angesammelt, die darauf hinwiesen, dass die meisten der bekannten mutagenen Faktoren hauptsächlich auf Nukleinsäuren und insbesondere auf DNA wirken (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 und andere).

Von besonderer Bedeutung für die Aufklärung der genetischen Rolle von Nukleinsäuren war die Untersuchung verschiedener Phagen und Viren. 1933 fand D. Schlesinger DNA im Bakteriophagen von Escherichia coli. Seit der Isolierung des Tabakmosaikvirus (TMV) im kristallinen Zustand durch W. Stanley (1935, Nobelpreis 1946) hat eine neue Etappe in der Erforschung von Pflanzenviren begonnen. 1937 - 1938. Mitarbeiter der Rothamsted Agricultural Station (England) F. Bowden und N. Peary zeigten, dass viele von ihnen isolierte Pflanzenviren keine Globuline, sondern Ribonukleoproteine ​​sind und Nukleinsäure als obligatorischen Bestandteil enthalten. Zu Beginn der 40er Jahre wurden die Arbeiten von G. Schramm (1940), P. A. Agatov (1941), G. Miller und W. Stanley (1941) veröffentlicht, die darauf hinweisen, dass eine merkliche chemische Veränderung der Proteinkomponente nicht zu einer merklichen chemischen Veränderung der Proteinkomponente führt zum Verlust der TMV-Infektiosität. Dies deutete darauf hin, dass die Proteinkomponente nicht der Träger der erblichen Eigenschaften des Virus sein konnte, wie viele Mikrobiologen weiterhin glaubten. Überzeugende Beweise für die genetische Rolle der Nukleinsäure (RNA) in Pflanzenviren wurden 1956 von G. Schramm in Tübingen (BRD) und H. Frenkel-Konrath in Kalifornien (USA) erbracht. Diese Forscher isolierten fast gleichzeitig und unabhängig voneinander RNA aus TMV und zeigten, dass dieses und nicht Protein infektiös ist: Durch die Infektion von Tabakpflanzen mit dieser RNA wurden in ihnen normale Viruspartikel gebildet und vermehrt. Dies bedeutete, dass die RNA Informationen für die Synthese und den Zusammenbau aller viralen Komponenten, einschließlich des viralen Proteins, enthielt. Im Jahr 1968 stellte I. G. Atabekov fest, dass Protein eine bedeutende Rolle bei der Infektion von Pflanzen selbst spielt – die Natur des Proteins bestimmt das Spektrum der Wirtspflanzen.

1957 führte Frenkel-Konrat erstmals die Rekonstruktion des TMV aus seinen Bestandteilen – RNA und Protein – durch. Neben normalen Partikeln erhielt er gemischte „Hybride“, bei denen die RNA von einem Stamm und das Protein von einem anderen stammte. Die Vererbung solcher Hybride wurde vollständig durch RNA bestimmt, und die Nachkommen der Viren gehörten zu dem Stamm, dessen RNA zur Gewinnung der ursprünglichen gemischten Partikel verwendet wurde. Später zeigten die Experimente von A. Gierer, G. Schuster und G. Schramm (1958) und G. Witman (1960 - 1966), dass die chemische Modifikation der TMV-Nukleinkomponente zum Auftreten verschiedener Mutanten dieses Virus führt.

1970 stellten D. Baltimore und G. Temin fest, dass die Übertragung genetischer Informationen nicht nur von DNA auf RNA, sondern auch umgekehrt erfolgen kann. Sie fanden in einigen onkogenen RNA-haltigen Viren (Oncornaviren) ein spezielles Enzym, die sogenannte Reverse Transkriptase, das in der Lage ist, komplementäre DNA an RNA-Ketten zu synthetisieren. Diese bedeutende Entdeckung ermöglichte es, den Mechanismus des Einbaus der genetischen Information RNA-haltiger Viren in das Wirtsgenom zu verstehen und einen neuen Blick auf die Natur ihrer onkogenen Wirkung zu werfen.

Entdeckung von Nukleinsäuren und Untersuchung ihrer Eigenschaften

Der Begriff Nukleinsäuren wurde 1889 vom deutschen Biochemiker R. Altman eingeführt, nachdem diese Verbindungen 1869 vom Schweizer Arzt F. Miescher entdeckt wurden. Misher extrahierte die Eiterzellen mehrere Wochen lang mit verdünnter Salzsäure und erhielt im weiteren Verlauf nahezu reines Kernmaterial. Er betrachtete dieses Material als eine charakteristische „Substanz von Zellkernen und nannte es Nuclein“. In seinen Eigenschaften unterschied sich Nuclein stark von Proteinen: Es war saurer, enthielt keinen Schwefel, enthielt aber viel Phosphor und war gut löslich in Laugen, löste sich jedoch nicht in verdünnten Säuren.

Misher schickte die Ergebnisse seiner Nukleinbeobachtungen an F. Goppe-Seyler zur Veröffentlichung in einer Zeitschrift. Die von ihm beschriebene Substanz war so ungewöhnlich (zu dieser Zeit war von allen biologischen phosphorhaltigen Verbindungen nur Lecithin bekannt), dass Goppe-Seyler Mishers Experimenten nicht glaubte, ihm das Manuskript zurückgab und seine Mitarbeiter N. Plosh und N. Lyubavin anwies Überprüfen Sie seine Schlussfolgerungen anhand anderer Materialien. Zwei Jahre später (1871) erschien Mieschers Werk „Über die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen“. Gleichzeitig wurden die Arbeiten von Goppe-Seyler und seinen Mitarbeitern über die Zusammensetzung von Eiterzellen, Erythrozyten von Vögeln, Schlangen und anderen Zellen veröffentlicht. In den nächsten drei Jahren wurde Nuklein aus tierischen Zellen und Hefe isoliert.

In seiner Arbeit stellte Misher fest, dass eine detaillierte Untersuchung verschiedener Nukleinsäuren zur Feststellung von Unterschieden zwischen ihnen führen kann, und nahm damit die Idee der Spezifität von Nukleinsäuren vorweg. Bei der Untersuchung von Lachsmilch stellte Misher fest, dass das darin enthaltene Nuklein in Form von Salz vorliegt und mit dem Hauptprotein, das er Protamin nannte, verbunden ist.

Im Jahr 1879 begann A. Kossel im Labor von Goppe-Seyler mit der Untersuchung von Nukleinen. 1881 isolierte er Hypoxanthin aus Nuklein, bezweifelte damals aber noch den Ursprung dieser Base und glaubte, dass es sich bei Hypoxanthin um ein Abbauprodukt von Proteinen handeln könnte. Im Jahr 1891 entdeckte Kossel unter den Produkten der Nukleinhydrolyse Adenin, Guanin, Phosphorsäure und eine weitere Substanz mit den Eigenschaften von Zucker. Für Forschungen zur Chemie der Nukleinsäuren erhielt Kossel 1910 den Nobelpreis.

Weitere Fortschritte bei der Entschlüsselung der Struktur von Nukleinsäuren sind mit der Forschung von P. Levin und Kollegen (1911 - 1934) verbunden. Im Jahr 1911 identifizierten P. Levin und V. Jacobs die Kohlenhydratkomponente von Adenosin und Guanosin; Sie fanden heraus, dass diese Nukleoside D-Ribose enthalten. Im Jahr 1930 zeigte Lewin, dass die Kohlenhydratkomponente von Desoxyribonukleosiden 2-Desoxy-D-Ribose ist. Aus seiner Arbeit wurde bekannt, dass Nukleinsäuren aus Nukleotiden, also phosphorylierten Nukleosiden, aufgebaut sind. Levin glaubte, dass der Hauptbindungstyp in Nukleinsäuren (RNA) die 2-Zoll-5-Zoll-Phosphodiesterbindung ist. Diese Vorstellung erwies sich als falsch. Dank der Arbeit des englischen Chemikers A. Todd (Nobelpreis 1957) und seiner Mitarbeiter sowie der englischen Biochemiker R. Markham und J. Smith wurde Anfang der 50er Jahre bekannt, dass die Hauptbindungsart in der RNA liegt ist 3", 5" - Phosphodiesterbindung.

Lewin zeigte, dass sich verschiedene Nukleinsäuren in der Art der Kohlenhydratkomponente unterscheiden können: Einige von ihnen enthalten den Zucker Desoxyribose, andere wiederum Ribose. Darüber hinaus unterschieden sich diese beiden Arten von Nukleinsäuren in der Natur einer der Basen: Nukleinsäuren vom Pentose-Typ enthielten Uracil und Nukleinsäuren vom Desoxypentose-Typ enthielten Thymin. Desoxypentose-Nukleinsäure (in der modernen Terminologie Desoxyribonukleinsäure – DNA) konnte normalerweise leicht in großen Mengen aus der Thymusdrüse (Süßdrüse) von Kälbern isoliert werden. Daher wurde es Thymonukleinsäure genannt. Die Quelle der Nukleinsäure (RNA) vom Pentosetyp waren hauptsächlich Hefe und Weizenkeime. Dieser Typ wurde oft als Hefe-Nukleinsäure bezeichnet.

In den frühen 1930er Jahren war die Vorstellung fest verankert, dass pflanzliche Zellen durch eine hefeartige Nukleinsäure gekennzeichnet seien, während Thymonukleinsäure nur für die Kerne tierischer Zellen charakteristisch sei. Die beiden Arten von Nukleinsäuren, RNA und DNA, wurden damals pflanzliche bzw. tierische Nukleinsäuren genannt. Wie jedoch die frühen Studien von A. N. Belozersky zeigten, ist eine solche Aufteilung der Nukleinsäuren ungerechtfertigt. Im Jahr 1934 entdeckte Belozersky erstmals Thymonukleinsäure in Pflanzenzellen: Aus Erbsenkeimlingen isolierte und identifizierte er die für die DNA charakteristische Thymin-Pyrimidin-Base. Dann entdeckte er Thymin in anderen Pflanzen (Sojasamen, Bohnen). Im Jahr 1936 isolierten A. N. Belozersky und I. I. Dubrovskaya präparativ DNA aus Rosskastaniensämlingen. Darüber hinaus zeigte eine Reihe von Studien, die D. Davidson und Mitarbeiter in den 1940er Jahren in England durchführten, überzeugend, dass pflanzliche Nukleinsäure (RNA) in vielen tierischen Zellen enthalten ist.

Die weit verbreitete Verwendung der von R. Felgen und G. Rosenbeck (1924) entwickelten zytochemischen Reaktion für DNA und der Reaktion von J. Brachet (1944) für RNA ermöglichte es, die Frage der bevorzugten Lokalisierung dieser Nukleinsäuren schnell und eindeutig zu lösen Säuren in der Zelle. Es stellte sich heraus, dass DNA im Zellkern konzentriert ist, während RNA überwiegend im Zytoplasma konzentriert ist. Später wurde festgestellt, dass RNA sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern enthalten ist, und außerdem wurde zytoplasmatische DNA identifiziert.

Was die Frage der Primärstruktur von Nukleinsäuren betrifft, so war Mitte der 1940er Jahre die Idee von P. Levin in der Wissenschaft fest verankert, wonach alle Nukleinsäuren nach dem gleichen Typ aufgebaut sind und aus demselben sogenannten Tetranukleotid bestehen Blöcke. Jeder dieser Blöcke enthält laut Lewin vier verschiedene Nukleotide. Die Tetranukleotidtheorie der Struktur von Nukleinsäuren entzog diesen Biopolymeren weitgehend ihre Spezifität. Daher ist es nicht verwunderlich, dass zu dieser Zeit alle Besonderheiten von Lebewesen nur mit Proteinen in Verbindung gebracht wurden, deren Monomere viel vielfältiger sind (20 Aminosäuren).

Die erste Lücke in der Theorie der Tetranukleotidstruktur von Nukleinsäuren wurde durch die analytischen Daten des englischen Chemikers J. Gouland (1945 - 1947) geschlossen. Bei der Bestimmung der Zusammensetzung von Nukleinsäuren anhand der Base Stickstoff gelangte er nicht zu einem äquimolaren Verhältnis der Basen, wie es nach Lewins Theorie hätte sein sollen. Schließlich brach die Tetranukleotidtheorie der Struktur von Nukleinsäuren aufgrund der Forschungen von E. Chargaff und seinen Mitarbeitern (1949 - 1951) zusammen. Chargaff nutzte die Papierchromatographie, um die Basen abzutrennen, die bei der Säurehydrolyse aus der DNA freigesetzt wurden. Jede dieser Basen wurde spektrophotometrisch genau bestimmt. Chargaff stellte deutliche Abweichungen vom äquimolaren Basenverhältnis in DNA unterschiedlicher Herkunft fest und stellte erstmals eindeutig fest, dass DNA eine ausgeprägte Speziesspezifität aufweist. Damit endete die Hegemonie des Konzepts der Proteinspezifität in der lebenden Zelle. Durch die Analyse von DNA unterschiedlicher Herkunft entdeckte und formulierte Chargaff einzigartige Muster der DNA-Zusammensetzung, die unter dem Namen Chargaffs Regeln Eingang in die Wissenschaft fanden. Nach diesen Regeln ist in jeder DNA, unabhängig von der Herkunft, die Menge an Adenin gleich der Menge an Thymin (A = T), die Menge an Guanin ist gleich der Menge an Cytosin (G = C), die Menge an Purine ist gleich der Menge an Pyrimidinen (G + A = C + T), die Menge an Basen mit 6-Aminogruppen ist gleich der Anzahl an Basen mit 6-Ketogruppen (A + C = G + T). Doch trotz dieser strengen quantitativen Übereinstimmungen ist DNA verschiedene Typen unterscheiden sich in der Größe des Verhältnisses A + T: G + C. In manchen DNA überwiegt die Menge an Guanin und Cytosin die Menge an Adenin und Thymin (Chargaff nannte diese DNA GC-Typ-DNA); andere DNAs enthielten mehr Adenin und Thymin als Guanin und Cytosin (diese DNAs wurden als AT-Typ-DNA bezeichnet). Die von Chargaff gewonnenen Daten zur Zusammensetzung der DNA spielten in der Molekularbiologie eine herausragende Rolle. Sie bildeten die Grundlage für die Entdeckung der DNA-Struktur im Jahr 1953 durch J. Watson und F. Crick.

Bereits 1938 zeigten W. Astbury und F. Bell mithilfe der Röntgenbeugungsanalyse, dass die Basisebenen der DNA senkrecht zur Längsachse des Moleküls stehen und sozusagen einem Stapel darauf liegender Platten ähneln sollten von einander. Mit der Verbesserung der Technik der Röntgenbeugungsanalyse von 1952 bis 1953. gesammelte Informationen, die es ermöglichten, die Länge einzelner Bindungen und die Neigungswinkel zu beurteilen. Dies ermöglichte es, mit größter Wahrscheinlichkeit die Art der Orientierung der Ringe der Pentosereste im Zucker-Phosphat-Rückgrat des DNA-Moleküls darzustellen. Im Jahr 1952 schlug S. Farberg zwei spekulative DNA-Modelle vor, die ein in sich selbst gefaltetes oder verdrehtes einzelsträngiges Molekül darstellten. Ein nicht weniger spekulatives Modell der DNA-Struktur wurde 1953 von L. Pauling (Nobelpreisträger 1954) und R. Corey vorgeschlagen. In diesem Modell bildeten drei verdrillte DNA-Stränge eine lange Helix, deren Kern durch Phosphatgruppen dargestellt wurde und deren Basen sich außerhalb befanden. Bis 1953 erhielten M. Wilkins und R. Franklin klarere Röntgenbeugungsmuster von DNA. Ihre Analyse zeigte das völlige Scheitern der Modelle von Farberg, Pauling und Corey. Anhand der Daten von Chargaff und durch den Vergleich verschiedener Kombinationen molekularer Modelle einzelner Monomere und Röntgenbeugungsdaten kamen J. Watson und F. Crick 1953 zu dem Schluss, dass das DNA-Molekül eine doppelsträngige Helix sein muss. Die Regeln von Chargaff schränkten die Anzahl der möglichen geordneten Basenkombinationen im vorgeschlagenen DNA-Modell stark ein; Sie schlugen Watson und Crick vor, dass es eine spezifische Basenpaarung im DNA-Molekül geben müsse – Adenin mit Thymin und Guanin mit Cytosin. Mit anderen Worten: Adenin in einem DNA-Strang entspricht immer genau Thymin im anderen Strang, und Guanin in einem Strang entspricht zwangsläufig Cytosin im anderen. So formulierten Watson und Crick als erste das äußerst wichtige Prinzip der komplementären Struktur der DNA, wonach ein DNA-Strang einen anderen ergänzt, d. h. die Basensequenz eines Strangs bestimmt eindeutig die Basensequenz im anderen (komplementären) Strang . Es wurde deutlich, dass bereits in der Struktur der DNA das Potenzial für ihre exakte Reproduktion liegt. Dieses Modell der DNA-Struktur wird derzeit allgemein akzeptiert. Crick, Watson und Wilkins erhielten 1962 den Nobelpreis für die Entschlüsselung der DNA-Struktur.

Es sei darauf hingewiesen, dass die Idee eines Mechanismus zur exakten Reproduktion von Makromolekülen und der Übertragung von Erbinformationen in unserem Land entstand. Im Jahr 1927 schlug N. K. Koltsov vor, dass bei der Zellreproduktion die Reproduktion von Molekülen durch exakte autokatalytische Reproduktion der vorhandenen Elternmoleküle erfolgt. Zwar stattete Koltsov diese Eigenschaft damals nicht mit DNA-Molekülen aus, sondern mit Molekülen proteinartiger Natur, deren funktionelle Bedeutung damals unbekannt war. Dennoch erwies sich die Idee der autokatalytischen Reproduktion von Makromolekülen und des Mechanismus der Übertragung erblicher Eigenschaften als prophetisch: Sie wurde zur Leitidee der modernen Molekularbiologie.

Die im Labor von A. N. Belozersky von A. S. Spirin, G. N. Zaitseva, B. F. Vanyushin, S. O. Uryson, A. S. Antonov und anderen verschiedenen Organismen durchgeführten Untersuchungen bestätigten vollständig die von Chargaff entdeckten Muster und die vollständige Übereinstimmung mit dem von Watson vorgeschlagenen molekularen Modell der DNA-Struktur und Crick. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass die DNA verschiedener Bakterien, Pilze, Algen, Actinomyceten, höherer Pflanzen, Wirbelloser und Wirbeltiere eine spezifische Zusammensetzung aufweist. Unterschiede in der Zusammensetzung (Gehalt an AT-Basenpaaren) sind bei Mikroorganismen besonders ausgeprägt und erweisen sich als wichtiges taxonomisches Merkmal. Bei höheren Pflanzen und Tieren sind die Artenunterschiede in der DNA-Zusammensetzung deutlich geringer ausgeprägt. Dies bedeutet jedoch nicht, dass ihre DNA weniger spezifisch ist. Neben der Zusammensetzung der Basen wird die Spezifität maßgeblich durch ihre Sequenz in DNA-Ketten bestimmt.

Neben den üblichen Basen wurden in DNA und RNA weitere stickstoffhaltige Basen gefunden. So fand G. White (1950) 5-Methylcytosin in der DNA von Pflanzen und Tieren, und D. Dunn und J. Smith (1958) fanden methyliertes Adenin in einigen DNAs. Methylcytosin galt lange Zeit als Kennzeichen des Erbguts höherer Organismen. Im Jahr 1968 fanden A. N. Belozersky, B. F. Vanyushin und N. A. Kokurina heraus, dass es auch in der DNA von Bakterien vorkommt.

1964 entdeckten M. Gold und J. Hurwitz eine neue Klasse von Enzymen, die die natürliche Modifikation der DNA – ihre Methylierung – durchführen. Nach dieser Entdeckung wurde klar, dass kleinere (in geringen Mengen enthaltene) Basen bereits auf der fertigen DNA-Polynukleotidkette als Ergebnis der spezifischen Methylierung von Cytosin- und Adeninresten in speziellen Sequenzen entstehen. Insbesondere nach B. F. Vanyushin, Ya. I. Buryanov und A. N. Belozersky (1969) kann Adeninmethylierung in E. coli-DNA in Terminationscodons auftreten. Laut A. N. Belozersky und Kollegen (1968 – 1970) sowie M. Meselson (USA) und V. Arber (Schweiz) (1965 – 1969) verleiht die Methylierung DNA-Molekülen einzigartige individuelle Merkmale und in Kombination mit der Wirkung von spezifische Nukleasen, ist Teil eines komplexen Mechanismus, der die DNA-Synthese in der Zelle steuert. Mit anderen Worten: Die Art der Methylierung einer bestimmten DNA bestimmt die Frage, ob sie sich in einer bestimmten Zelle vermehren kann.

Fast zeitgleich begann die Isolierung und intensive Untersuchung von DNA-Methylasen und Restriktionsendonukleasen; 1969 - 1975 Die von einigen dieser Enzyme in der DNA erkannten Nukleotidsequenzen wurden ermittelt (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Wenn unterschiedliche DNAs durch ein Restriktionsenzym hydrolysiert werden, werden ziemlich große Fragmente mit identischen „klebrigen“ Enden herausgespalten. Dies ermöglicht nicht nur die Analyse der Struktur von Genen, wie dies bei kleinen Viren der Fall ist (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), sondern auch die Konstruktion verschiedener Genome. Mit der Entdeckung dieser spezifischen Restriktionsenzyme ist die Gentechnik greifbare Realität geworden. Eingebettet in kleine Plasmid-DNA lassen sich Gene unterschiedlicher Herkunft bereits leicht in verschiedene Zellen einschleusen. So wurde eine neue Art biologisch aktiver Plasmide erhalten, die Resistenzen gegen bestimmte Antibiotika verleihen (S. Cohen, 1973), ribosomale Gene eines Frosches und von Drosophila wurden in Escherichia coli-Plasmide eingeführt (J. Morrow, 1974; X. Boyer, D . Hogness, R. Davis, 1974 - 1975). Somit stehen echte Wege offen, um durch die Einführung und Integration verschiedener Gene in ihren Genpool grundlegend neue Organismen zu erhalten. Diese Entdeckung kann zum Wohle der gesamten Menschheit genutzt werden.

Im Jahr 1952 entdeckten G. White und S. Cohen, dass die DNA von T-even-Phagen eine ungewöhnliche Base enthält – 5-Hydroxymethylcytosin. Später wurde aus den Arbeiten von E. Volkin und R. Sinsheimer (1954) und Cohen (1956) bekannt, dass Hydroxymethylcytosinreste ganz oder teilweise glukosidiert werden können, wodurch das Phagen-DNA-Molekül vor der hydrolytischen Wirkung geschützt wird von Nukleasen.

In den frühen 1950er Jahren wurde aus den Arbeiten von D. Dunn und J. Smith (England), S. Zamenhof (USA) und A. Wacker (Deutschland) bekannt, dass viele künstliche Basenanaloge in die DNA eingebaut werden können und diese manchmal ersetzen bis zu 50 % Thymin. Diese Substitutionen führen in der Regel zu Fehlern bei der DNA-Replikation, -Transkription und -Translation und zum Auftreten von Mutanten. So fand J. Marmur (1962) heraus, dass die DNA einiger Phagen Oxymethyluracil anstelle von Thymin enthält. 1963 entdeckten I. Takahashi und J. Marmur, dass die DNA eines der Phagen Uracil anstelle von Thymin enthält. Damit brach ein anderes Prinzip zusammen, nach dem Nukleinsäuren zuvor getrennt wurden. Seit P. Levins Arbeiten glaubt man, dass Thymin das Markenzeichen der DNA und Uracil das Markenzeichen der RNA ist. Es wurde deutlich, dass dieses Zeichen nicht immer zuverlässig ist und der grundlegende Unterschied in der chemischen Natur der beiden Arten von Nukleinsäuren, wie es heute scheint, nur in der Natur der Kohlenhydratkomponente besteht.

Bei der Untersuchung von Phagen wurden viele ungewöhnliche Merkmale der Organisation von Nukleinsäuren entdeckt. Seit 1953 glaubt man, dass alle DNA doppelsträngige lineare Moleküle sind, während RNA nur einzelsträngig ist. Diese Position wurde 1961 erheblich erschüttert, als R. Sinsheimer entdeckte, dass die DNA des Phagen φ X 174 durch ein einzelsträngiges kreisförmiges Molekül repräsentiert wird. Später stellte sich jedoch heraus, dass diese DNA in dieser Form nur in einem vegetativen Phagenpartikel vorkommt und die replikative Form der DNA dieses Phagen ebenfalls doppelsträngig ist. Darüber hinaus stellte sich als völlig unerwartet heraus, dass die RNA einiger Viren doppelsträngig sein kann. Diese neue Art der makromolekularen Organisation von RNA wurde 1962 von P. Gomatos, I. Tamm und anderen Forschern bei einigen tierischen Viren und bei pflanzlichen Wundtumorviren entdeckt. Kürzlich stellten V. I. Agol und A. A. Bogdanov (1970) fest, dass es neben linearen RNA-Molekülen auch geschlossene oder zyklische Moleküle gibt. Sie entdeckten zyklische doppelsträngige RNA insbesondere im Enzephalomyelocarditis-Virus. Dank der Arbeiten von X. Deveaux, L. Tinoko, T. I. Tikhonenko, E. I. Budovsky und anderen (1960 - 1974) wurden die Hauptmerkmale der Organisation (Verlegung) von genetischem Material in Bakteriophagen bekannt.

In den späten 1950er Jahren fand der amerikanische Wissenschaftler P. Doty heraus, dass Erhitzen eine DNA-Denaturierung verursacht, die mit dem Aufbrechen von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Basenpaaren und der Trennung komplementärer Ketten einhergeht. Dieser Prozess hat den Charakter eines „Spiral-Coil“-Phasenübergangs und ähnelt dem Schmelzen von Kristallen. Daher bezeichnete Doty den Prozess der thermischen Denaturierung der DNA als DNA-Schmelzen. Bei langsamer Abkühlung kommt es zur Renaturierung von Molekülen, also zur Wiedervereinigung komplementärer Hälften.

Das Prinzip der Renaturierung wurde 1960 von J. Marmur und K. Schildkraut genutzt, um den Grad der „Hybridisierbarkeit“ der DNA verschiedener Mikroorganismen zu bestimmen. Anschließend verbesserten E. Bolton und B. McCarthy diese Technik, indem sie die Methode der sogenannten DNA-Agar-Säulen vorschlugen. Diese Methode erwies sich als unverzichtbar für die Untersuchung des Homologiegrades der Nukleotidsequenz verschiedener DNA und die Aufklärung der genetischen Verwandtschaft verschiedener Organismen. Die von Doty entdeckte Denaturierung der DNA in Kombination mit der von J. Mandel und A. Hershey * (1960) beschriebenen Chromatographie auf methyliertem Albumin und der Zentrifugation im Dichtegradienten (die Methode wurde 1957 von M. Meselson, F. Stahl und entwickelt D. Winograd) wird häufig zur Trennung, Isolierung und Analyse einzelner komplementärer DNA-Stränge verwendet. Beispielsweise zeigte W. Shibalsky (USA), der diese Techniken zur Trennung der DNA des Lambda-Phagen verwendete, 1967 - 1969, dass beide Phagenketten vorhanden sind genetisch aktiv und nicht einer, wie angenommen wurde (S. Spiegelman, 1961). Es sei darauf hingewiesen, dass die Idee der genetischen Bedeutung beider DNA-Stränge des Lambda-Phagen zum ersten Mal in der UdSSR von SE Bresler (1961) geäußert wurde.

* (Für ihre Arbeiten zur Genetik von Bakterien und Viren erhielten A. Hershey zusammen mit M. Delbrück und S. Luria 1969 den Nobelpreis.)

Um die Organisation und funktionelle Aktivität des Genoms zu verstehen, ist die Bestimmung der DNA-Nukleotidsequenz von größter Bedeutung. Die Suche nach Methoden für eine solche Bestimmung wird in vielen Laboren auf der ganzen Welt durchgeführt. Seit Ende der 1950er Jahre versuchten M. Beer und seine Mitarbeiter in den USA, die DNA-Sequenz mittels Elektronenmikroskopie zu etablieren, bisher jedoch ohne Erfolg. In den frühen 1950er Jahren wurde aus den ersten Arbeiten von Sinsheimer, Chargaff und anderen Forschern zum enzymatischen Abbau von DNA bekannt, dass verschiedene Nukleotide in einem DNA-Molekül zwar nicht zufällig, sondern ungleichmäßig verteilt sind. Nach Angaben des englischen Chemikers C. Barton (1961) liegen Pyrimidine (mehr als 70 %) hauptsächlich in Form der entsprechenden Blöcke vor. A. L. Mazin und B. F. Vanyushin (1968 - 1969) fanden heraus, dass verschiedene DNAs einen unterschiedlichen Grad an Pyrimidin-Kohäsion aufweisen und dass dieser in der DNA tierischer Organismen deutlich zunimmt, wenn sie sich von niedriger zu höher bewegt. Somit spiegelt sich die Evolution von Organismen auch in der Struktur ihrer Genome wider. Um den Evolutionsprozess als Ganzes zu verstehen, ist daher eine vergleichende Untersuchung der Struktur von Nukleinsäuren erforderlich spezielle Bedeutung. Die Analyse der Struktur biologisch wichtiger Polymere und vor allem der DNA ist für die Lösung vieler spezifischer Probleme der Phylogenetik und Taxonomie äußerst wichtig.

Es ist interessant festzustellen, dass der englische Physiologe E. Lankester, der die Hämoglobine von Mollusken untersuchte, die Ideen der Molekularbiologie vor genau 100 Jahren vorwegnahm und schrieb: „Chemische Unterschiede zwischen verschiedenen Arten und Gattungen von Tieren und Pflanzen sind ebenso wichtig für die Klärung.“ die Geschichte ihrer Entstehung als ihre Form. Wenn wir die Unterschiede in der molekularen Organisation und Funktionsweise von Organismen klar feststellen könnten, könnten wir den Ursprung und die Entwicklung verschiedener Organismen viel besser verstehen als auf der Grundlage morphologischer Beobachtungen. Die Bedeutung biochemischer Studien für die Taxonomie wurde auch von VL Komarov betont, der schrieb, dass „die Grundlage aller sogar rein morphologischen Merkmale, auf deren Grundlage wir Arten klassifizieren und etablieren, gerade biochemische Unterschiede sind“ ** .

* (E. R. Lankester. Über das Vorkommen von Hämoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- „Pfluger“ s Archiv für die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

** (V. L. Komarov. Ausgewählte Werke, Bd. 1. M.-L., Verlag der Akademie der Wissenschaften der UdSSR, 1945, S. 331.)

A. V. Blagoveshchenskii und S. L. Ivanov unternahmen bereits in den 1920er Jahren in unserem Land die ersten Schritte, um bestimmte Fragen der Evolution und Systematik von Organismen auf der Grundlage einer vergleichenden Analyse ihrer biochemischen Zusammensetzung zu klären (siehe Kapitel 2). Die vergleichende Analyse der Struktur von Proteinen und Nukleinsäuren wird für Taxonomen mittlerweile zu einem immer greifbareren Werkzeug (siehe Kapitel 21). Diese Methode der Molekularbiologie ermöglicht nicht nur die Klärung der Lage bestimmte Typen im System, sondern zwingt uns auch dazu, die Prinzipien der Klassifizierung von Organismen neu zu betrachten und manchmal das gesamte System als Ganzes zu überarbeiten, wie es beispielsweise bei der Systematik der Mikroorganismen der Fall war. Zweifellos wird die Analyse der Struktur des Genoms in Zukunft einen zentralen Platz in der Chemosystematik von Organismen einnehmen.

Von großer Bedeutung für die Entwicklung der Molekularbiologie war die Entschlüsselung der Mechanismen der DNA-Replikation und -Transkription (siehe Kapitel 24).

Proteinbiosynthese

Ein wichtiger Wandel bei der Lösung des Problems der Proteinbiosynthese ist mit Fortschritten bei der Untersuchung von Nukleinsäuren verbunden. 1941 machten T. Kasperson (Schweden) und 1942 J. Brachet (Belgien) darauf aufmerksam, dass Gewebe mit aktiver Proteinsynthese eine erhöhte Menge an RNA enthalten. Sie kamen zu dem Schluss, dass Ribonukleinsäuren eine entscheidende Rolle bei der Proteinsynthese spielen. Im Jahr 1953 scheinen E. Gale und D. Fox direkte Beweise für die direkte Beteiligung von RNA an der Proteinbiosynthese erhalten zu haben: Ihren Daten zufolge unterdrückte Ribonuklease den Einbau von Aminosäuren in Bakterienzelllysaten deutlich. Ähnliche Daten wurden von V. Olfri, M. Delhi und A. Mirsky (1953) zu Leberhomogenaten erhalten. Später lehnte E. Gale seine korrekte Vorstellung von der führenden Rolle der RNA bei der Proteinsynthese ab und glaubte fälschlicherweise, dass die Aktivierung der Proteinsynthese in einem zellfreien System unter dem Einfluss einer anderen Substanz unbekannter Natur erfolgt. Im Jahr 1954 fanden P. Zamechnik, D. Littlefield, R. B. Khesin-Lurie und andere heraus, dass der aktivste Einbau von Aminosäuren in RNA-reichen Fraktionen subzellulärer Partikel – Mikrosomen – erfolgt. P. Zamechnik und E. Keller (1953 – 1954) fanden heraus, dass der Einbau von Aminosäuren in Gegenwart des Überstands unter Bedingungen der ATP-Regeneration merklich verstärkt wurde. P. Sikevitz (1952) und M. Hoagland (1956) isolierten eine Proteinfraktion (pH-5-Fraktion) aus dem Überstand, die für die starke Stimulation des Einbaus von Aminosäuren in Mikrosomen verantwortlich war. Neben Proteinen wurde im Überstand eine spezielle Klasse niedermolekularer RNAs gefunden, die heute Transfer-RNAs (tRNAs) genannt werden. Im Jahr 1958 fanden Hoagland und Zamechnik sowie P. Berg, R. Sweet und F. Allen und viele andere Forscher heraus, dass jede Aminosäure ihr eigenes spezielles Enzym, ATP, und eine spezifische tRNA zur Aktivierung benötigt. Es wurde deutlich, dass tRNAs ausschließlich die Funktion von Adaptern erfüllen, also von Geräten, die auf der Nukleinsäurematrix (mRNA) einen Platz für die entsprechende Aminosäure im entstehenden Proteinmolekül finden. Diese Studien bestätigten vollständig die Adapterhypothese von F. Crick (1957), die die Existenz von Polynukleotidadaptern in der Zelle vorsah, die für die korrekte Anordnung der Aminosäurereste des synthetisierten Proteins auf der Nukleinmatrix erforderlich sind. Viel später zeigte der französische Wissenschaftler F. Chapville (1962) im Labor von F. Lipman (Nobelpreis 1953) in den USA sehr genial und eindeutig, dass die Position einer Aminosäure in einem synthetisierten Proteinmolekül vollständig durch die bestimmt wird spezifische tRNA, an die es gebunden ist. Cricks Adapterhypothese wurde von Hoagland und Zamechnik entwickelt.

Bis 1958 wurden folgende Hauptschritte der Proteinsynthese bekannt: 1) Aktivierung einer Aminosäure durch ein spezifisches Enzym aus der „pH 5-Fraktion“ in Gegenwart von ATP unter Bildung von Aminoacyladenylat; 2) Anheftung einer aktivierten Aminosäure an eine spezifische tRNA unter Freisetzung von Adenosinmonophosphat (AMP); 3) Bindung von Aminoacyl-tRNA (mit einer Aminosäure beladene tRNA) an Mikrosomen und Einbau von Aminosäuren in ein Protein unter Freisetzung von tRNA. Hoagland (1958) stellte fest, dass Guanosintriphosphat (GTP) im letzten Stadium der Proteinsynthese benötigt wird.

Transfer-RNAs und Gensynthese

Nach der Entdeckung der tRNAs begann eine aktive Suche nach ihrer Fraktionierung und Bestimmung der Nukleotidsequenz. Den größten Erfolg erzielte der amerikanische Biochemiker R. Holly. 1965 etablierte er die Struktur der Alanin-tRNA aus Hefe. Mithilfe von Ribonukleasen (Guanyl-RNase und Pankreas-RNase) teilte Holly das Nukleinsäuremolekül in mehrere Fragmente auf, bestimmte die Nukleotidsequenz in jedem von ihnen separat und rekonstruierte dann die Sequenz des gesamten Alanin-tRNA-Moleküls. Diese Art der Analyse der Nukleotidsequenz wird als Blockmethode bezeichnet. Hollys Verdienst bestand vor allem darin, dass er lernte, das RNA-Molekül nicht nur in kleine Stücke zu teilen, wie es viele vor ihm taten, sondern auch in große Fragmente (Viertel und Hälften). Dies gab ihm die Möglichkeit, einzelne kleine Stücke richtig zusammenzusetzen und so die vollständige Nukleotidsequenz des gesamten tRNA-Moleküls wiederherzustellen (Nobelpreis, 1968).

Diese Technik wurde sofort von vielen Laboren auf der ganzen Welt übernommen. In den nächsten zwei Jahren wurde die Primärstruktur mehrerer tRNAs in der UdSSR und im Ausland entschlüsselt. A. A. Baev (1967) und Mitarbeiter etablierten erstmals die Nukleotidsequenz in Hefe-Valin-tRNA. Bisher wurden mehr als ein Dutzend verschiedene individuelle tRNAs untersucht. Ein besonderer Rekord bei der Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde in Cambridge von F. Senger und G. Brownlee aufgestellt. Diese Forscher entwickelten eine überraschend elegante Methode zur Trennung von Oligonukleotiden und zur Sequenzierung der sogenannten 5 S (ribosomalen) RNA aus E. coli-Zellen (1968). Diese RNA besteht aus 120 Nukleotidresten und enthält im Gegensatz zur tRNA keine zusätzlichen Nebenbasen, die die Analyse der Nukleotidsequenz erheblich erleichtern und als einzigartige Orientierungspunkte für einzelne Fragmente des Moleküls dienen. Dank der Verwendung der Sanger- und Brownlee-Methode werden derzeit die Arbeiten zur Untersuchung der Sequenz langer ribosomaler RNAs und einiger viraler RNAs im Labor von J. Ebel (Frankreich) und anderen Forschern erfolgreich vorangetrieben.

A. A. Baev und Kollegen (1967) fanden heraus, dass halbierte Valin-tRNA in Lösung ihre makromolekulare Struktur wiederherstellt und trotz eines Defekts in der Primärstruktur die funktionelle Aktivität des ursprünglichen (nativen) Moleküls aufweist. Dieser Ansatz – die Rekonstruktion eines geschnittenen Makromoleküls nach Entfernung bestimmter Fragmente – erwies sich als sehr vielversprechend. Mittlerweile wird es häufig verwendet, um die funktionelle Rolle einzelner Abschnitte bestimmter tRNAs aufzuklären.

In den letzten Jahren wurden große Erfolge bei der Gewinnung kristalliner Präparate einzelner tRNAs erzielt. Viele tRNAs wurden bereits in mehreren Laboren in den USA und England kristallisiert. Dadurch war es möglich, die Struktur der tRNA mittels Röntgenbeugungsanalyse zu untersuchen. 1970 präsentierte R. Bock die ersten Röntgenmuster und dreidimensionalen Modelle mehrerer tRNAs, die er an der University of Wisconsin erstellt hatte. Diese Modelle helfen dabei, die Lokalisierung einzelner funktionell aktiver Stellen in der tRNA zu bestimmen und die Grundprinzipien der Funktionsweise dieser Moleküle zu verstehen.

Von größter Bedeutung für die Aufklärung des Mechanismus der Proteinsynthese und die Lösung des Problems der Spezifität dieses Prozesses war die Entschlüsselung der Natur des genetischen Codes (siehe Kapitel 24), die ohne Übertreibung als die führende Errungenschaft der Proteinsynthese angesehen werden kann Naturwissenschaften des 20. Jahrhunderts.

Die Entdeckung der Primärstruktur von tRNA durch R. Holly gab der Arbeit von G. Korana * (USA) zur Synthese von Oligonukleotiden Anstoß und richtete sie auf die Synthese einer spezifischen biologischen Struktur – eines DNA-Moleküls, das Alanin-tRNA kodiert. Die ersten Schritte der chemischen Synthese kurzer Oligonukleotide, die der Koran vor fast 15 Jahren vornahm, gipfelten 1970 in der ersten Gensynthese. Koran und seine Mitarbeiter synthetisierten zunächst chemisch kurze Fragmente von 8–12 Nukleotidresten einzelner Nukleotide. Diese Fragmente mit einer gegebenen Nukleotidsequenz bildeten spontan doppelsträngige komplementäre Stücke mit einer Überlappung von 4–5 Nukleotiden. Anschließend wurden diese fertigen Stücke mithilfe des Enzyms DNA-Ligase in der richtigen Reihenfolge aneinandergefügt. Im Gegensatz zur Replikation von DNA-Molekülen gelang es dem Koran laut A. Kornberg ** (siehe Kapitel 24), ein natürliches doppelsträngiges DNA-Molekül nach einem vorgeplanten Programm gemäß neu zu erschaffen die von Holly beschriebene tRNA-Sequenz. In ähnlicher Weise wird derzeit an der Synthese anderer Gene gearbeitet (M. N. Kolosov, Z. A. Shabarova, D. G. Knorre, 1970 - 1975).

* (Für die Erforschung des genetischen Codes erhielten G. Koran und M. Nirenberg 1968 den Nobelpreis.)

** (Für die Entdeckung der Polymerase und DNA-Synthese wurde A. Kornberg und für die Synthese von RNA S. Ochoa 1959 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet.)

Mikrosomen, Ribosomen, Übersetzung

Mitte der 1950er Jahre glaubte man, dass Mikrosomen das Zentrum der Proteinsynthese in der Zelle seien. Der Begriff Mikrosomen wurde erstmals 1949 von A. Claude eingeführt, um die Fraktion kleiner Körnchen zu bezeichnen. Später stellte sich heraus, dass nicht der gesamte Mikrosomenanteil, bestehend aus Membranen und Körnchen, für die Proteinsynthese verantwortlich ist, sondern nur kleine Ribonukleoproteinpartikel. Diese Partikel wurden 1958 von R. Roberts Ribosomen genannt.

Klassische Studien zu bakteriellen Ribosomen wurden 1958–1959 von A. Tisier und J. Watson durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass bakterielle Ribosomen etwas kleiner waren als pflanzliche und tierische. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) und E. N. Svetailo (1966) zeigten, dass die Ribosomen der Chloroplasten höherer Pflanzen und Mitochondrien zum Bakterientyp gehören. A. Tisier und andere (1958) fanden heraus, dass Ribosomen in zwei ungleiche Untereinheiten dissoziieren, die jeweils ein RNA-Molekül enthalten. In den späten 50er Jahren glaubte man, dass jedes ribosomale RNA-Molekül aus mehreren kurzen Fragmenten besteht. AS Spirin war jedoch 1960 der erste, der zeigte, dass RNA in Subpartikeln durch ein kontinuierliches Molekül repräsentiert wird. D. Waller (1960) stellte bei der Trennung ribosomaler Proteine ​​mittels Stärkegelelektrophorese fest, dass sie sehr heterogen sind. Zunächst zweifelten viele an Wallers Daten, da es den Anschein hatte, dass das Ribosomenprotein streng homogen sein sollte, wie beispielsweise das TMV-Protein. Derzeit ist durch die Forschungen von D. Waller, R. Trout, P. Traub und anderen Biochemikern bekannt geworden, dass die Zusammensetzung der eigentlichen ribosomalen Partikel mehr als 50 Proteine ​​umfasst, die sich in ihrer Struktur völlig unterscheiden. AS Spirin war 1963 der erste, der ribosomale Subpartikel entfaltete und zeigte, dass Ribosomen ein kompakt verdrehter Ribonukleoproteinstrang sind, der sich unter bestimmten Bedingungen entfalten kann. 1967 - 1968 M. Nomura rekonstruierte vollständig eine biologisch aktive Untereinheit aus ribosomaler RNA und Protein und erhielt sogar Ribosomen, in denen Protein und RNA zu verschiedenen Mikroorganismen gehörten.

Die Rolle der ribosomalen RNA ist noch unklar. Es wird angenommen, dass es sich um jene einzigartige spezifische Matrix handelt, auf der bei der Bildung eines ribosomalen Partikels jedes der zahlreichen ribosomalen Proteine ​​einen genau definierten Platz findet (AS Spirin, 1968).

A. Rich (1962) entdeckte Aggregate mehrerer Ribosomen, die durch einen mRNA-Strang miteinander verbunden waren. Diese Komplexe wurden Polysomen genannt. Die Entdeckung von Polysomen ermöglichte Rich und Watson (1963) die Annahme, dass die Synthese der Polypeptidkette am Ribosom erfolgt, das sich sozusagen entlang der mRNA-Kette bewegt. Während sich das Ribosom entlang der mRNA-Kette bewegt, werden Informationen im Partikel ausgelesen und die Protein-Polypeptidkette gebildet, und neue Ribosomen heften sich abwechselnd an das freigesetzte Leseende der mRNA. Aus den Daten von Rich und Watson ging hervor, dass die Bedeutung von Polysomen in einer Zelle in der Massenproduktion von Proteinen durch sukzessives Lesen der Matrix durch mehrere Ribosomen gleichzeitig liegt.

Als Ergebnis der Forschungen von M. Nirenberg, S. Ochoa, F. Lipman, G. Korana und anderen in den Jahren 1963 - 1970. Es wurde bekannt, dass neben mRNA, Ribosomen, ATP und Aminoacyl-tRNA eine Vielzahl verschiedener Faktoren am Translationsprozess beteiligt sind und der Translationsprozess selbst bedingt in drei Phasen unterteilt werden kann – Initiation, Translation selbst und Termination.

Unter Translationsinitiierung versteht man die Synthese der ersten Peptidbindung im Komplex Ribosom – Matrizenpolynukleotid – Aminoacyl-tRNA. Eine solche initiatorische Aktivität besitzt keine Aminoacyl-tRNA, sondern Formylmethionyl-tRNA. Diese Substanz wurde erstmals 1964 von F. Senger und K. Marker isoliert. S. Bretcher und K. Marker (1966) zeigten, dass die initiierende Funktion der Formylmethionyl-tRNA auf ihrer erhöhten Affinität zum Peptidylzentrum des Ribosoms beruht. Für den Beginn der Translation sind auch einige Proteininitiationsfaktoren äußerst wichtig, die in den Labors von S. Ochoa, F. Gro und anderen Forschungszentren isoliert wurden. Nach der Bildung der ersten Peptidbindung im Ribosom beginnt die eigentliche Translation, d. h. die sequentielle Addition eines Aminoacylrests an den C-Terminus des Polypeptids. Viele Details des Übersetzungsprozesses wurden von K. Monroe und J. Bishop (England), I. Rykhlik und F. Shorm (Tschechoslowakei), F. Lipman, M. Bretcher, W. Gilbert (USA) und anderen Forschern untersucht. Im Jahr 1968 schlug A. S. Spirin eine originelle Hypothese vor, um den Mechanismus des Ribosoms zu erklären. Der Antriebsmechanismus, der alle räumlichen Bewegungen von tRNA und mRNA während der Translation gewährleistet, ist das periodische Öffnen und Schließen von Ribosomen-Subpartikeln. Die Translationstermination ist in der lesbaren Matrix selbst kodiert, die die Terminationscodons enthält. Wie S. Brenner (1965 - 1967) zeigte, sind die Tripletts UAA, UAG und UGA solche Codons. M. Capecci (1967) identifizierte auch spezielle Proteinterminationsfaktoren. AS Spirin und LP Gavrilova beschrieben die sogenannte „nicht-enzymatische“ Proteinsynthese in Ribosomen (1972 - 1975) ohne Beteiligung von Proteinfaktoren. Diese Entdeckung ist wichtig für das Verständnis des Ursprungs und der Entwicklung der Proteinbiosynthese.

Regulierung der Gen- und Proteinaktivität

Nach dem Problem der Spezifität der Proteinsynthese stellte sich in erster Linie das Problem der Regulierung der Proteinsynthese oder, was dasselbe ist, der Regulierung der Genaktivität, in der Molekularbiologie heraus.

Die funktionelle Inäquivalenz von Zellen und die damit verbundene Unterdrückung und Aktivierung von Genen haben seit langem die Aufmerksamkeit von Genetikern auf sich gezogen, doch bis vor kurzem blieb der tatsächliche Mechanismus zur Steuerung der Genaktivität unbekannt.

Die ersten Versuche, die regulatorische Aktivität von Genen zu erklären, waren mit der Untersuchung von Histonproteinen verbunden. Sogar die Ehepartner von Steadman * in den frühen 40er Jahren des 20. Jahrhunderts. schlugen vor, dass Histone die Hauptrolle bei diesem Phänomen spielen könnten. Anschließend erhielten sie erste klare Daten über Unterschiede in der chemischen Natur von Histonproteinen. Gegenwärtig nimmt die Zahl der Fakten, die diese Hypothese stützen, von Jahr zu Jahr zu.

* (E. Stedman, E. Stedman. Die Grundproteine ​​der Zellkerne.- Philosoph. Trans. Roy. soc. London, 1951, v. 235, 565 - 595.)

Gleichzeitig häufen sich immer mehr Daten, die darauf hinweisen, dass die Regulierung der Genaktivität ein weitaus komplexerer Prozess ist als die einfache Interaktion von Genabschnitten mit Histon-Proteinmolekülen. 1960 - 1962 Im Labor von R. B. Khesin-Lurie wurde festgestellt, dass die Phagengene nicht gleichzeitig abgelesen werden: Die T2-Phagengene können in frühe Gene unterteilt werden, deren Funktion in den ersten Minuten der Infektion einer Bakterienzelle erfolgte und späte, die nach Abschluss der Arbeit früher Gene mit der Synthese von mRNA begannen.

1961 schlugen die französischen Biochemiker F. Jacob und J. Monod ein Schema zur Regulierung der Genaktivität vor, das eine herausragende Rolle beim Verständnis der Regulierungsmechanismen der Zelle im Allgemeinen spielte. Nach dem Schema von Jacob und Monod enthält die DNA neben strukturellen (Informations-)Genen auch Gen-Regulatoren und Gen-Operatoren. Das Regulator-Gen kodiert für die Synthese einer bestimmten Substanz – eines Repressors, der sowohl an das Induktor- als auch an das Operator-Gen binden kann. Das Operator-Gen ist mit Strukturgenen verknüpft, während das Regulator-Gen in einiger Entfernung von diesen liegt. Wenn in der Umgebung kein Induktor vorhanden ist, beispielsweise Laktose, dann bindet der vom Regulatorgen synthetisierte Repressor an das Operatorgen und schaltet durch seine Blockierung die Arbeit des gesamten Operons (ein Block von Strukturgenen zusammen mit dem Operator) ab das sie kontrolliert). Unter diesen Bedingungen findet keine Enzymbildung statt. Wenn im Medium ein Induktor (Laktose) vorkommt, bindet das Produkt des Regulatorgens, der Repressor, an Laktose und hebt die Blockade des Operatorgens auf. In diesem Fall wird die Arbeit des Strukturgens, das die Synthese des Enzyms kodiert, möglich und das Enzym (Laktose) erscheint im Medium.

Nach Jacob und Monod ist dieses Regulationsschema auf alle adaptiven Enzyme anwendbar und kann sowohl bei der Repression, wenn die Bildung des Enzyms durch einen Überschuss des Reaktionsprodukts unterdrückt wird, als auch bei der Induktion, wenn die Einführung eines Substrats bewirkt, erfolgen die Synthese des Enzyms. Für Studien zur Regulierung der Genaktivität erhielten Jacob und Monod 1965 den Nobelpreis.

Zunächst schien dieses Schema zu weit hergeholt. Später stellte sich jedoch heraus, dass die Regulierung von Genen nach diesem Prinzip nicht nur bei Bakterien, sondern auch bei anderen Organismen erfolgt.

Seit 1960 nehmen Studien zur Organisation des Genoms und zur Struktur des Chromatins in eukaryotischen Organismen einen herausragenden Platz in der Molekularbiologie ein (J. Bonner, R. Britten, W. Olfrey, P. Walker, Yu. S. Chentsov). , I. B. Zbarsky und andere .) und Regulierung der Transkription (A. Mirsky, G. P. Georgiev, M. Bernstiel, D. Goll, R. Tsanev, R. I. Salganik). Die Natur des Repressors blieb lange Zeit unbekannt und umstritten. 1968 zeigte M. Ptashne (USA), dass ein Protein ein Repressor ist. Er isolierte es im Labor von J. Watson und stellte fest, dass der Repressor tatsächlich eine Affinität zum Induktor (Laktose) hat und gleichzeitig das Operator-Gen des Lac-Operons „erkennt“ und spezifisch daran bindet.

In den letzten 5 bis 7 Jahren wurden Daten über das Vorhandensein einer weiteren Kontrollzelle der Genaktivität – des Promotors – erhoben. Es stellte sich heraus, dass es neben der Operatorstelle, an der das am Genregulator synthetisierte Produkt – die Proteinsubstanz des Repressors – gebunden ist, eine weitere Stelle gibt, die ebenfalls den Mitgliedern des Genregulationssystems zugeordnet werden sollte Aktivität. An dieser Stelle ist ein Proteinmolekül des Enzyms RNA-Polymerase befestigt. In der Promotorregion muss eine gegenseitige Erkennung der einzigartigen Nukleotidsequenz in der DNA und der spezifischen Konfiguration des RNA-Polymerase-Proteins erfolgen. Die Umsetzung des Prozesses des Lesens genetischer Informationen mit einer bestimmten Gensequenz des an den Promotor angrenzenden Operons hängt von der Erkennungseffizienz ab.

Neben dem von Jacob und Monod beschriebenen Schema gibt es noch weitere Mechanismen der Genregulation in der Zelle. F. Jacob und S. Brenner (1963) stellten fest, dass die Regulation der bakteriellen DNA-Replikation in gewisser Weise durch die Zellmembran gesteuert wird. Die Experimente von Jacob (1954) zur Induktion verschiedener Prophagen zeigten überzeugend, dass unter dem Einfluss verschiedener mutagener Faktoren in der Zelle lysogener Bakterien die selektive Replikation des Prophagen-Gens beginnt und die Replikation des Wirtsgenoms blockiert wird. 1970 berichtete F. Bell, dass kleine DNA-Moleküle vom Zellkern in das Zytoplasma gelangen und dort transkribiert werden können.

Somit kann die Genaktivität auf der Ebene der Replikation, Transkription und Translation reguliert werden.

Bei der Untersuchung der Regulierung nicht nur der Synthese von Enzymen, sondern auch ihrer Aktivität wurden erhebliche Fortschritte erzielt. A. Novik und L. Szilard wiesen bereits in den 1950er Jahren auf die Phänomene der Regulierung der Aktivität von Enzymen in der Zelle hin. G. Umbarger (1956) fand heraus, dass es in der Zelle eine sehr rationale Möglichkeit gibt, die Aktivität des Enzyms durch das Endprodukt der Rückkopplungsreaktionskette zu unterdrücken. Wie J. Monod, J. Change, F. Jacob, A. Purdy und andere Forscher (1956 – 1960) feststellten, kann die Regulierung der Enzymaktivität nach dem allosterischen Prinzip erfolgen. Das Enzym oder eine seiner Untereinheiten hat zusätzlich zur Affinität zum Substrat eine Affinität zu einem der Produkte der Reaktionskette. Unter dem Einfluss eines solchen Signalprodukts verändert das Enzym seine Konformation derart, dass es an Aktivität verliert. Dadurch wird die gesamte Kette enzymatischer Reaktionen von Anfang an abgeschaltet. D. Wieman und R. Woodward (1952; Nobelpreisträger 1965) wiesen auf die wesentliche Rolle von Proteinkonformationsänderungen bei enzymatischen Reaktionen und in gewissem Sinne auf das Vorhandensein eines allosterischen Effekts hin.

Struktur und Funktion von Proteinen

Als Ergebnis der Arbeit von T. Osborn, G. Hofmeister, A. Gurber, F. Schulz und vielen anderen am Ende des 19. Jahrhunderts. Viele tierische und pflanzliche Proteine ​​liegen in kristalliner Form vor. Etwa zur gleichen Zeit wurden die Molekulargewichte bestimmter Proteine ​​mit verschiedenen physikalischen Methoden bestimmt. So berichteten A. Sabaneev und N. Alexandrov 1891, dass das Molekulargewicht von Ovalbumin 14.000 beträgt; 1905 fand E. Reid heraus, dass das Molekulargewicht von Hämoglobin 48.000 beträgt. Die Polymerstruktur von Proteinen wurde 1871 von G. Glasivetz und D. Gaberman entdeckt. Die Idee einer Peptidbindung einzelner Aminosäurereste in Proteinen wurde von T. Curtius (1883) vorgebracht. Arbeiten zur chemischen Kondensation von Aminosäuren (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano und D. Traschiatti, 1900) und zur Synthese von Heteropolypeptiden (E. Fisher, 1902 - 1907, Nobelpreis, 1902) führte zur Entwicklung der Grundprinzipien der chemischen Struktur von Proteinen.

Das erste kristalline Enzym (Urease) wurde 1926 von J. Sumner (Nobelpreis, 1946) erhalten, und 1930 erhielt J. Northrop (Nobelpreis, 1946) kristallines Pepsin. Nach diesen Arbeiten wurde klar, dass Enzyme proteinischer Natur sind. 1940 isolierte M. Kunits kristalline RNase. Bis 1958 waren bereits mehr als 100 kristalline Enzyme und über 500 nichtkristalline Enzyme bekannt. Die Gewinnung hochreiner Präparate einzelner Proteine ​​trug zur Entschlüsselung ihrer Primärstruktur und makromolekularen Organisation bei.

Von großer Bedeutung für die Entwicklung der Molekularbiologie im Allgemeinen und der Humangenetik im Besonderen war die Entdeckung von abnormalem Hämoglobin S durch L. Pauling (1940), das aus den Erythrozyten von Menschen mit einer schweren Erbkrankheit, der Sichelzellenanämie, isoliert wurde. 1955 - 1957 W. Ingram nutzte die von F. Sanger entwickelte „Fingerprint“-Methode (Flecken, die durch einzelne Peptide während der Chromatographie auf Papier gebildet werden), um die Produkte der Hydrolyse von Hämoglobin S mit Alkali und Trypsin zu analysieren. Im Jahr 1961 berichtete Ingram, dass sich Hämoglobin S vom normalen Hämoglobin nur durch die Art eines Aminosäurerests unterscheidet: in normales Hämoglobin An der siebten Position der Kette befindet sich ein Glutaminsäurerest und im Hämoglobin S ein Valinrest. Damit wurde Paulings Annahme (1949), dass es sich bei der Sichelzellenanämie um eine Krankheit molekularer Natur handelt, voll und ganz bestätigt. Eine vererbte Veränderung nur eines Aminosäurerests in jeder Hälfte des Hämoglobin-Makromoleküls führt dazu, dass Hämoglobin bei niedriger Sauerstoffkonzentration seine Fähigkeit verliert, sich leicht aufzulösen und zu kristallisieren beginnt, was zu einer Störung der Zellstruktur führt. Diese Studien zeigten deutlich, dass die Struktur eines Proteins eine streng definierte Aminosäuresequenz ist, die im Genom kodiert ist. Die Arbeiten von K. Anfinsen (1951) bezeugten die außerordentliche Bedeutung der Primärstruktur eines Proteins für die Bildung einer einzigartigen biologisch aktiven Konformation eines Makromoleküls. Anfinsen zeigte, dass die biologisch aktive Makrostruktur der Pankreas-Ribonuklease, die durch die Wiederherstellung verloren geht, durch die Aminosäuresequenz vorgegeben ist und bei der Oxidation von SH-Gruppen von Cysteinresten spontan unter Bildung von Disulfidvernetzungen im strengen Sinne wieder auftauchen kann definierte Stellen der Peptidkette des Enzyms.

Bisher wurde der Wirkmechanismus einer Vielzahl von Enzymen eingehend untersucht und die Struktur vieler Proteine ​​aufgeklärt.

1953 etablierte F. Sanger die Aminosäuresequenz von Insulin. : Dieses Protein besteht aus zwei Polypeptidketten, die durch zwei Disulfidvernetzungen verbunden sind. Eine der Ketten enthält nur 21 Aminosäurereste, während die andere 30 Reste enthält. Sanger verbrachte etwa zehn Jahre damit, die Struktur dieses relativ einfachen Proteins zu entschlüsseln. Für diese herausragende Forschung erhielt er 1958 den Nobelpreis. Nach der Entwicklung eines automatischen Aminosäureanalysators durch V. Stein und S. Moore (1957) beschleunigte sich die Identifizierung von Produkten der teilweisen Hydrolyse von Proteinen erheblich. Stein und Moore berichteten bereits 1960 darüber. dass sie in der Lage waren, die Sequenz der Ribonuklease zu bestimmen, deren Peptidkette aus 124 Aminosäureresten besteht. Im selben Jahr bestimmten F. Anderer und andere im Labor von G. Schramm in Tübingen (Deutschland) die Aminosäuresequenz im TMV-Protein. Anschließend wurde die Aminosäuresequenz in Myoglobin (A. Edmunson) und α- und β-Ketten von menschlichem Hämoglobin (G. Braunitzer, E. Schroeder usw.), Lysozym aus Eiprotein (J. Jollet, D. Keyfield) bestimmt. . 1963 etablierten F. Shorm und B. Keil (Tschechoslowakei) die Aminosäuresequenz im Chymotrypsinogen-Molekül. Im selben Jahr wurde die Aminosäuresequenz von Trypsinogen bestimmt (F. Shorm, D. Walsh). 1965 etablierte K. Takahashi die Primärstruktur der Ribonuklease T1. Anschließend wurde die Aminosäuresequenz für mehrere weitere Proteine ​​bestimmt.

Der endgültige Beweis für die Richtigkeit der Definition einer bestimmten Struktur ist bekanntlich ihre Synthese. Im Jahr 1969 führte R. Merifield (USA) als erster die chemische Synthese der Pankreas-Ribonuklease durch. Mit der von ihm entwickelten Synthesemethode auf einem Festphasenträger fügte Merifield der Kette eine Aminosäure nach der anderen hinzu, entsprechend der von Stein und Moore beschriebenen Sequenz. Als Ergebnis erhielt er ein Protein, das in seinen Eigenschaften mit der Pankreas-Ribonuklease A identisch war. Für die Entdeckung der Struktur der Ribonuklease wurden V. Stein, S. Moore und K. Anfinsen 1972 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Diese natürliche Proteinsynthese eröffnet enorme Perspektiven und weist auf die Möglichkeit hin, beliebige Proteine ​​nach einer vorgeplanten Reihenfolge herzustellen.

Aus Röntgenuntersuchungen von W. Astbury (1933) ging hervor, dass die Peptidketten von Proteinmolekülen auf eine genau definierte Weise verdreht oder gestapelt sind. Seitdem haben viele Autoren verschiedene Hypothesen über die Art und Weise aufgestellt, wie Proteinketten gefaltet werden, aber bis 1951 blieben alle Modelle spekulative Konstruktionen, die nicht mit experimentellen Daten übereinstimmten. 1951 veröffentlichten L. Pauling und R. Corey eine Reihe brillanter Arbeiten, in denen schließlich die Theorie der Sekundärstruktur von Proteinen, die Theorie der α-Helix, formuliert wurde. Damit einhergehend wurde auch bekannt, dass Proteine ​​auch eine Tertiärstruktur haben: Die α-Helix der Peptidkette kann auf bestimmte Weise gefaltet werden, wodurch eine recht kompakte Struktur entsteht.

1957 machten J. Kendrew und seine Mitarbeiter erstmals einen Vorschlag 3D-Modell Myoglobinstrukturen. Dieses Modell wurde dann über mehrere Jahre hinweg verfeinert, bis 1961 die endgültige Arbeit mit einer Charakterisierung der räumlichen Struktur dieses Proteins erschien. 1959 etablierten M. Perutz und Kollegen die dreidimensionale Struktur von Hämoglobin. Die Forscher verbrachten mehr als 20 Jahre mit dieser Arbeit (die ersten Röntgenaufnahmen von Hämoglobin wurden 1937 von Perutz gemacht). Da das Hämoglobinmolekül aus vier Untereinheiten besteht, beschrieb Perutz nach der Entschlüsselung seiner Organisation erstmals die Quartärstruktur des Proteins. Für ihre Arbeiten zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen erhielten Kendrew und Perutz 1962 den Nobelpreis.

Die Erstellung eines räumlichen Modells der Struktur von Hämoglobin durch Perutz ERLAUBT. um dem Verständnis des Funktionsmechanismus dieses Proteins näher zu kommen, das bekanntermaßen den Sauerstofftransport in tierischen Zellen durchführt. Bereits 1937 kam F. Gaurowitz zu dem Schluss, dass die Wechselwirkung von Hämoglobin mit Sauerstoff und Luft mit einer Veränderung der Proteinstruktur einhergehen sollte. In den 1960er Jahren entdeckten Perutz und Mitarbeiter eine merkliche Verschiebung der Hämoglobinketten nach der Oxidation, die durch die Verschiebung von Eisenatomen infolge der Bindung mit Sauerstoff verursacht wurde. Auf dieser Grundlage entstanden Vorstellungen über das „Atmen“ von Proteinmakromolekülen.

1960 begannen D. Phillips und seine Mitarbeiter mit Röntgenbeugungsstudien des Lysozymmoleküls. Bis 1967 waren sie mehr oder weniger in der Lage, die Einzelheiten der Organisation dieses Proteins und der Lokalisierung einzelner Atome in seinem Molekül zu klären. Darüber hinaus fand Phillips die Art der Zugabe von Lysozym zum Substrat (Triacetylglucosamin) heraus. Dadurch war es möglich, den Mechanismus dieses Enzyms nachzubilden. Die Kenntnis der Primärstruktur und der makromolekularen Organisation ermöglichte es daher, nicht nur die Natur der aktiven Zentren vieler Enzyme zu bestimmen, sondern auch den Funktionsmechanismus dieser Makromoleküle vollständig aufzudecken.

Der Einsatz elektronenmikroskopischer Methoden trug dazu bei, die Prinzipien der makromolekularen Organisation solch komplexer Proteinformationen wie Kollagen, Fibrinogen, kontraktile Muskelfibrillen usw. aufzudecken. Ende der 1950er Jahre wurden Modelle des Muskelkontraktilapparats vorgeschlagen. Von außerordentlicher Bedeutung für das Verständnis des Mechanismus der Muskelkontraktion war die Entdeckung der ATPase-Aktivität von Myosin durch V. A. Engelgardt und M. N. Lyubimova (1939). Dies bedeutete, dass der Akt der Muskelkontraktion auf einer Veränderung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der makromolekularen Organisation des kontraktilen Proteins unter dem Einfluss von Adenosintriphosphorsäure beruht (siehe auch Kapitel 11).

Virologische Forschung war für das Verständnis der Prinzipien des Aufbaus biologischer Strukturen von entscheidender Bedeutung (siehe Kapitel 25).

Ungeklärte Probleme

Die wichtigsten Fortschritte in der modernen Molekularbiologie wurden hauptsächlich durch die Untersuchung von Nukleinsäuren erzielt. Allerdings sind auch in diesem Bereich längst nicht alle Probleme gelöst. Insbesondere die Entschlüsselung der gesamten Nukleotidsequenz des Genoms wird große Anstrengungen erfordern. Dieses Problem wiederum ist untrennbar mit dem Problem der DNA-Heterogenität verbunden und erfordert die Entwicklung neuer fortschrittlicher Methoden zur Fraktionierung und Isolierung einzelner Moleküle aus dem gesamten genetischen Material der Zelle.

Bisher konzentrierten sich die Bemühungen hauptsächlich auf die getrennte Untersuchung von Proteinen und Nukleinsäuren. In der Zelle sind diese Biopolymere untrennbar miteinander verbunden und funktionieren hauptsächlich in Form von Nukleoproteinen. Daher ist die Notwendigkeit, die Wechselwirkung von Proteinen und Nukleinsäuren zu untersuchen, mittlerweile besonders groß. Das Problem der Erkennung bestimmter Nukleinsäureabschnitte durch Proteine ​​wird in den Vordergrund gerückt. Es wurden bereits Schritte zur Untersuchung einer solchen Wechselwirkung dieser Biopolymere skizziert, ohne die ein vollständiges Verständnis der Struktur und Funktionen von Chromosomen, Ribosomen und anderen Strukturen undenkbar ist. Ohne dies ist es auch unmöglich, die Regulation der Genaktivität zu verstehen und schließlich die Funktionsprinzipien proteinsynthetisierender Mechanismen zu entschlüsseln. Nach der Arbeit von Jacob und Monod erschienen einige neue Daten zur regulatorischen Bedeutung von Membranen bei der Synthese von Kernmaterial. Dies wirft das Problem einer tiefergehenden Untersuchung der Rolle von Membranen bei der Regulierung der DNA-Replikation auf. Im Allgemeinen ist das Problem der Regulierung der Genaktivität und der Zellaktivität im Allgemeinen zu einem der wichtigsten Probleme der modernen Molekularbiologie geworden.

Der aktuelle Stand der Biophysik

In engem Zusammenhang mit den Problemen der Molekularbiologie verlief die Entwicklung der Biophysik. Das Interesse an diesem Bereich der Biologie wurde einerseits durch die Notwendigkeit einer umfassenden Untersuchung der Wirkung verschiedener Strahlungsarten auf den Körper und andererseits durch die Notwendigkeit, die physikalischen und physikalischen Aspekte zu untersuchen, geweckt physikalisch-chemische Grundlagen von Lebensphänomenen auf molekularer Ebene.

Durch den Einsatz neuer feinphysikalischer und chemischer Methoden wurde es möglich, genaue Informationen über molekulare Strukturen und die in ihnen ablaufenden Prozesse zu erhalten. Basierend auf den Errungenschaften der Elektrochemie war es möglich, die Methode zur Messung bioelektrischer Potentiale durch den Einsatz ionenselektiver Elektroden zu verbessern (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60er Jahre). Zunehmend wird die Infrarotspektroskopie (unter Verwendung von Lasergeräten) praktiziert, die es ermöglicht, Konformationsänderungen in Proteinen zu untersuchen (I. Plotnikov, 1940). Wertvolle Informationen liefern auch die Methode der paramagnetischen Elektronenresonanz (E. K. Zavoisky, 1944) und die Biochemilumineszenzmethode (B. N. Tarusov et al., 1960), die es insbesondere ermöglichen, den Elektronentransport bei oxidativen Prozessen zu beurteilen.

Bereits in den 1950er Jahren erlangte die Biophysik eine starke Stellung. Es besteht Bedarf an der Ausbildung qualifizierter Fachkräfte. Hatte 1911 in Europa nur die Universität Pécs in Ungarn einen Lehrstuhl für Biophysik, so gab es 1973 solche Lehrstühle an fast allen großen Universitäten.

1960 wurde die International Society of Biophysicists gegründet. Im August 1961 fand in Stockholm der erste Internationale Biophysikalische Kongress statt. Der zweite Kongress fand 1965 in Paris statt, der dritte 1969 in Boston und der vierte 1972 in Moskau.

In der Biophysik gibt es eine klare Unterscheidung zwischen zwei Bereichen unterschiedlichen Inhalts – der molekularen Biophysik und der zellulären Biophysik. Diese Unterscheidung erhält auch einen organisatorischen Ausdruck: Es werden eigene Abteilungen dieser beiden Bereiche der Biophysik geschaffen. An der Moskauer Universität wurde 1953 die erste Abteilung für Biophysik an der Fakultät für Biologie und Bodenkunde gegründet, und wenig später entstand an der Fakultät für Physik die Abteilung für Biophysik. An vielen anderen Universitäten waren die Fachbereiche nach dem gleichen Prinzip organisiert.

Molekulare Biophysik

In den letzten Jahren wurde die Verbindung zwischen molekularer Biophysik und Molekularbiologie immer stärker, und es ist mittlerweile manchmal schwierig zu bestimmen, wo die Trennlinie zwischen ihnen verläuft. Bei einem allgemeinen Angriff auf das Problem der Erbinformation ist eine solche Zusammenarbeit zwischen Biophysik und Molekularbiologie unvermeidlich.

Die Hauptrichtung in Forschungsarbeit ist das Studium der Physik der Nukleinsäuren – DNA und RNA. Der Einsatz der oben genannten Methoden und vor allem der Röntgenbeugungsanalyse trugen zur Entschlüsselung bei molekulare Struktur Nukleinsäuren. Derzeit wird intensiv daran geforscht, das Verhalten dieser Säuren in Lösungen zu untersuchen. Besonderes Augenmerk wird auf die „Helix-Coil“-Konformationsübergänge gelegt, die anhand von Änderungen der Viskosität sowie optischer und elektrischer Parameter untersucht werden. Im Zusammenhang mit der Untersuchung der Mechanismen der Mutagenese werden Studien entwickelt, um die Wirkung ionisierender Strahlung auf das Verhalten von Nukleinsäuren in Lösungen sowie die Wirkung von Strahlung auf die Nukleinsäuren von Viren und Phagen zu untersuchen. Die Wirkung ultravioletter Strahlung, deren Spektralbereiche bekanntermaßen von Nukleinsäuren gut absorbiert werden, wurde einer umfassenden Analyse unterzogen. Ein großer Teil dieser Art von Forschung ist der Nachweis aktiver Radikale von Nukleinsäuren und Proteinen mit der Methode der paramagnetischen Elektronenresonanz. Mit der Anwendung dieser Methode ist die Entstehung einer ganz eigenständigen Richtung verbunden.

Das Problem der Kodierung von DNA- und RNA-Informationen und ihrer Übertragung während der Proteinsynthese ist seit langem von Interesse für die molekulare Biophysik, und Physiker haben wiederholt bestimmte Überlegungen zu diesem Thema geäußert (E. Schrödinger, G. Gamow). Die Entschlüsselung des genetischen Codes führte zu zahlreichen theoretischen und experimentellen Studien zur Struktur der DNA-Helix, dem Mechanismus des Gleitens und Verdrehens ihrer Stränge körperliche Stärke an diesen Prozessen beteiligt sind.

Die molekulare Biophysik unterstützt die Molekularbiologie erheblich bei der Untersuchung der Struktur von Proteinmolekülen mit Hilfe der Röntgenbeugungsanalyse, die erstmals 1930 von J. Bernal eingesetzt wurde. Durch den Einsatz physikalischer Methoden in Kombination mit biochemischen (enzymatischen) Methoden konnten die molekulare Konformation und die Reihenfolge der Aminosäuren in einer Reihe von Proteinen aufgeklärt werden.

Moderne elektronenmikroskopische Untersuchungen, die das Vorhandensein komplexer Membransysteme in Zellen und ihren Organellen offenbarten, regten Versuche an, ihre molekulare Struktur zu verstehen (siehe Kapitel 10 und 11). In vivo untersucht chemische Zusammensetzung Membranen und insbesondere die Eigenschaften ihrer Lipide. Es wurde festgestellt, dass letztere zu Überoxidation und nichtenzymatischen Reaktionen der Kettenoxidation fähig sind (Yu. A. Vladimirov und F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov et al., 1960; I. I. Ivanov, 1967), was zu einer Membranfunktionsstörung führt. Um die Zusammensetzung von Membranen zu untersuchen, wurden auch Methoden der mathematischen Modellierung eingesetzt (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).

Zelluläre Biophysik

Ein bedeutendes Ereignis in der Geschichte der Biophysik war die Bildung klarer Vorstellungen über die Thermodynamik biologischer Prozesse in den 50er Jahren, wodurch Annahmen über die Möglichkeit einer unabhängigen Energieerzeugung in lebenden Zellen im Widerspruch zum zweiten Hauptsatz der Thermodynamik entstanden. endlich verschwunden. Das Verständnis der Wirkungsweise dieses Gesetzes in biologischen Systemen ist mit der Einführung des Konzepts offener Systeme, die Energie und Materie mit der äußeren Umgebung austauschen, durch den belgischen Wissenschaftler I. Prigogine (1945) * in die biologische Thermodynamik verbunden. Prigogine zeigte, dass in lebenden Zellen bei Arbeitsprozessen gemäß dem zweiten Hauptsatz der Thermodynamik positive Entropie entsteht. Die von ihm eingeführten Gleichungen bestimmten die Bedingungen, unter denen der sogenannte stationäre Zustand entsteht (früher wurde er auch dynamisches Gleichgewicht genannt), in dem die Menge an freier Energie (Negentropie), die mit der Nahrung in die Zellen gelangt, deren Verbrauch kompensiert, und positive Entropie ist Ausgang. Diese Entdeckung verstärkte die allgemeine biologische Idee der untrennbaren Verbindung zwischen der äußeren und inneren Umgebung von Zellen. Es markierte den Beginn einer echten Untersuchung der Thermodynamik lebender Systeme, einschließlich der Modellierungsmethode (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (Die allgemeine Theorie offener Systeme wurde erstmals 1932 von L. Bertalanffy aufgestellt.)

Nach dem Grundprinzip der Biothermodynamik ist die Stationarität in der Entwicklung seiner biochemischen Prozesse eine notwendige Voraussetzung für die Existenz des Lebens, für deren Umsetzung es notwendig ist, die Geschwindigkeiten zahlreicher Stoffwechselreaktionen zu koordinieren. Auf der Grundlage der neuen biophysikalischen Thermodynamik hat sich ein Trend herausgebildet, der äußere und innere Faktoren hervorhebt, die diese Koordination der Reaktionen sicherstellen und stabil machen. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde gezeigt, dass Inhibitoren und insbesondere Antioxidantien eine große Rolle bei der Aufrechterhaltung des stationären Zustands des Systems spielen (B. N. Tarusov und A. I. Zhuravlev, 1954, 1958). Es wurde festgestellt, dass die Zuverlässigkeit der stationären Entwicklung mit Umweltfaktoren (Temperatur) und zusammenhängt physikalische und chemische Eigenschaften Zellumgebungen.

Moderne Prinzipien der Biothermodynamik haben eine physikalisch-chemische Interpretation des Anpassungsmechanismus ermöglicht. Nach unseren Daten kann eine Anpassung an Umweltbedingungen nur dann erfolgen, wenn der Organismus bei deren Veränderung in der Lage ist, eine Stationarität in der Bioentwicklung herzustellen chemische Reaktionen(B. N. Tarusov, 1974). Es stellte sich die Frage, neue Methoden zu entwickeln, die es ermöglichen würden, den stationären Zustand in vivo zu beurteilen und mögliche Verletzungen vorherzusagen. Die Einführung kybernetischer Prinzipien selbstregulierender Systeme in die Biothermodynamik und die Erforschung biologischer Anpassungsprozesse verspricht großen Nutzen. Es wurde deutlich, dass es zur Lösung des Problems der Stabilität des Steady State wichtig ist, die sogenannten Störfaktoren zu berücksichtigen, zu denen insbesondere nicht-enzymatische Reaktionen der Lipidoxidation zählen. In jüngster Zeit nehmen die Untersuchungen zu Peroxidationsprozessen in den Lipidphasen lebender Zellen und zum Wachstum aktiver Radikalprodukte zu, die die regulatorischen Funktionen von Membranen stören. Die Informationsquelle über diese Prozesse ist sowohl der Nachweis aktiver Peroxidradikale als auch Peroxidverbindungen von Biolipiden (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 und andere). Zum Nachweis von Radikalen wird die Biochemilumineszenz genutzt, die in den Lipiden lebender Zellen bei deren Rekombination auftritt.

Auf der Grundlage physikalisch-chemischer Vorstellungen über die Stabilität des Steady State entstanden biophysikalische Vorstellungen über die Anpassung von Pflanzen an Veränderungen der Umweltbedingungen als Verletzung hemmender Antioxidationssysteme (B. N. Tarusov, Ya. E. Doskoch, B. M. Kitlaev, A. M. Agaverdiev, 1968 - 1972). Dies eröffnete die Möglichkeit, Eigenschaften wie Frostbeständigkeit und Salztoleranz zu bewerten und entsprechende Vorhersagen bei der Auswahl landwirtschaftlicher Pflanzen zu treffen.

In den 1950er Jahren wurde ein ultraschwaches Leuchten entdeckt – die Biochemilumineszenz einer Reihe biologischer Objekte im sichtbaren und infraroten Teil des Spektrums (B. N. Tarusov, A. I. Zhuravlev, A. I. Polivoda). Möglich wurde dies durch die Entwicklung von Methoden zur Registrierung superschwacher Lichtflüsse mithilfe von Photomultipliern (L. A. Kubetsky, 1934). Als Ergebnis biochemischer Reaktionen in einer lebenden Zelle ermöglicht die Biochemilumineszenz die Beurteilung wichtiger oxidativer Prozesse in den Elektronentransferketten zwischen Enzymen. Die Entdeckung und Untersuchung der Biochemilumineszenz ist von großer theoretischer und praktischer Bedeutung. So weisen B. N. Tarusov und Yu. B. Kudryashov auf die große Rolle der Oxidationsprodukte ungesättigter Fettsäuren im Mechanismus des Auftretens pathologischer Zustände hin, die sich unter dem Einfluss ionisierender Strahlung entwickeln, bei der Karzinogenese und anderen Störungen der normalen Zellfunktionen .

In den 1950er Jahren entstand im Zusammenhang mit der rasanten Entwicklung der Kernphysik aus der Biophysik die Radiobiologie, die die biologische Wirkung ionisierender Strahlung untersucht. Gewinnung künstlicher radioaktiver Isotope, Herstellung thermonuklearer Waffen, Kernreaktoren und Entwicklung anderer praktischer Anwendungsformen Atomenergie stellte mit aller Schärfe das Problem des Schutzes von Organismen vor den schädlichen Auswirkungen ionisierender Strahlung und die Entwicklung theoretischer Grundlagen für die Prävention und Behandlung von Strahlenkrankheiten. Dazu musste zunächst herausgefunden werden, welche Bestandteile der Zelle und Stoffwechselglieder am anfälligsten sind.

Gegenstand des Studiums der Biophysik und Strahlenbiologie war die Aufklärung der Natur der primären chemischen Reaktionen, die in lebenden Substraten unter dem Einfluss von Strahlungsenergie ablaufen. Hier war es wichtig, nicht nur die Mechanismen dieses Phänomens zu verstehen, sondern auch den Prozess des Austauschs physikalischer Energie gegen chemische Energie beeinflussen zu können, um seinen „nützlichen“ Wirkungskoeffizienten zu reduzieren. Die Arbeit in dieser Richtung wurde durch die Studien der Schule von N. N. Semenov (1933) in der UdSSR und D. Hinshelwood (1935) in England eingeleitet.

Einen wichtigen Platz in der strahlenbiologischen Forschung nahm die Untersuchung des Strahlenresistenzgrades verschiedener Organismen ein. Es wurde festgestellt, dass eine erhöhte Strahlenresistenz (z. B. bei Wüstennagetieren) auf die hohe antioxidative Aktivität von Zellmembranlipiden zurückzuführen ist (M. Chang et al., 1964; N. K. Ogryzov et al., 1969). Es stellte sich heraus, dass Tocopherole, Vitamin K und Thioverbindungen eine wichtige Rolle bei der Bildung der antioxidativen Eigenschaften dieser Systeme spielen (II Ivanov et al., 1972). In den letzten Jahren haben auch Untersuchungen zu den Mechanismen der Mutagenese große Aufmerksamkeit erregt. Zu diesem Zweck wird die Wirkung ionisierender Strahlung auf das Verhalten von Nukleinsäuren und Proteinen in vitro sowie in Viren und Phagen untersucht (A. Gustafson, 1945 – 1950).

Der Kampf um eine weitere Steigerung der Wirksamkeit des Chemikalienschutzes, die Suche nach wirksameren Inhibitoren und Hemmprinzipien bleiben die Hauptaufgaben der Biophysik in dieser Richtung.

Bei der Untersuchung der angeregten Zustände von Biopolymeren, die ihre hohe chemische Aktivität bestimmen, wurden Fortschritte erzielt. Am erfolgreichsten war die Untersuchung angeregter Zustände, die im Primärstadium photobiologischer Prozesse – Photosynthese und Sehvermögen – entstehen.

Damit wurde ein wichtiger Beitrag zum Verständnis der primären Aktivierung der Moleküle pflanzlicher Pigmentsysteme geleistet. Die große Bedeutung der verlustfreien Übertragung (Migration) der Energie angeregter Zustände von aktivierten Pigmenten auf andere Substrate wurde nachgewiesen. Eine wichtige Rolle bei der Entwicklung dieser Ideen spielten die theoretischen Arbeiten von A. N. Terenin (1947 und später). A. A. Krasnovsky (1949) entdeckte und untersuchte die Reaktion der reversiblen photochemischen Reduktion von Chlorophyll und seinen Analoga. Mittlerweile besteht die allgemeine Überzeugung, dass es in naher Zukunft möglich sein wird, die Photosynthese unter künstlichen Bedingungen zu reproduzieren (siehe auch Kapitel 5).

Biophysiker arbeiten weiterhin daran, die Natur der Muskelkontraktion und die Mechanismen der Nervenerregung und -leitung aufzudecken (siehe Kapitel 11). Von aktueller Bedeutung ist auch die Erforschung der Mechanismen des Übergangs von einem angeregten Zustand in einen Normalzustand. Der angeregte Zustand wird heute als Ergebnis einer autokatalytischen Reaktion angesehen, und die Hemmung wird als Folge einer starken Mobilisierung der inhibitorischen antioxidativen Aktivität infolge molekularer Umlagerungen in Verbindungen wie Tocopherol angesehen (I. I. Ivanov, O. R. Kols, 1966; O. R. Kols, 1970).

Das wichtigste allgemeine Problem der Biophysik bleibt die Kenntnis der qualitativen physikalischen und chemischen Eigenschaften lebender Materie. Eigenschaften wie die Fähigkeit lebender Biopolymere, Kalium selektiv zu binden oder elektrischen Strom zu polarisieren, bleiben auch bei sorgfältigster Entfernung aus dem Körper nicht erhalten. Daher entwickelt die Zellbiophysik weiterhin intensiv Kriterien und Methoden für die lebenslange Untersuchung lebender Materie.

Obwohl die Molekularbiologie noch jung ist, sind die Fortschritte, die sie auf diesem Gebiet gemacht hat, wirklich atemberaubend. Für relativ kurzfristig Die Natur des Gens und die Grundprinzipien seiner Organisation, Reproduktion und Funktion wurden festgestellt. Darüber hinaus wurde nicht nur die In-vitro-Reproduktion von Genen durchgeführt, sondern erstmals auch die vollständige Synthese des Gens selbst abgeschlossen. Der genetische Code wurde vollständig entschlüsselt und das wichtigste biologische Problem der Spezifität der Proteinbiosynthese gelöst. Die wichtigsten Wege und Mechanismen der Proteinbildung in der Zelle wurden identifiziert und untersucht. Die Primärstruktur vieler Transport-RNAs, spezifischer Adaptermoleküle, die die Sprache der Nukleinsäurematrizen in die Sprache der Aminosäuresequenz des synthetisierten Proteins übersetzen, wurde vollständig aufgeklärt. Die Aminosäuresequenz vieler Proteine ​​ist vollständig entschlüsselt und die räumliche Struktur einiger von ihnen ist aufgeklärt. Dies ermöglichte es, das Prinzip und die Details der Funktionsweise von Enzymmolekülen aufzuklären. Die chemische Synthese eines der Enzyme, der Ribonuklease, wurde durchgeführt. Die Grundprinzipien der Organisation verschiedener subzellulärer Partikel, vieler Viren und Phagen wurden etabliert und die wichtigsten Wege ihrer Biogenese in der Zelle aufgeklärt. Es wurden Ansätze zum Verständnis der Regulationsmechanismen der Genaktivität und zur Aufklärung der Regulationsmechanismen lebenswichtiger Aktivität entdeckt. Bereits eine einfache Aufzählung dieser Entdeckungen weist darauf hin, dass es sich um die zweite Hälfte des 20. Jahrhunderts handelt. war von enormen Fortschritten in der Biologie geprägt, die vor allem auf eine eingehende Untersuchung der Struktur und Funktionen biologisch wichtiger Makromoleküle – Nukleinsäuren und Proteine ​​– zurückzuführen sind.

Errungenschaften der Molekularbiologie werden bereits heute in der Praxis genutzt und bringen greifbare Ergebnisse in der Medizin, der Landwirtschaft und einigen Industrien. Es besteht kein Zweifel, dass die Rendite dieser Wissenschaft von Tag zu Tag zunehmen wird. Als Hauptergebnis ist jedoch dennoch zu bedenken, dass unter dem Einfluss der Erfolge der Molekularbiologie das Vertrauen in die Existenz unbegrenzter Möglichkeiten auf dem Weg zur Enthüllung der geheimsten Geheimnisse des Lebens gestärkt wurde.

In Zukunft werden offenbar neue Wege zur Untersuchung der biologischen Form der Materiebewegung eröffnet – die Biologie wird von der molekularen Ebene auf die atomare Ebene übergehen. Allerdings gibt es derzeit möglicherweise keinen einzigen Forscher, der die Entwicklung der Molekularbiologie selbst für die nächsten 20 Jahre realistisch vorhersagen könnte.

Comicbuch zum Wettbewerb „bio/mol/text“: Heute Molekularbiologe Das Reagenzglas führt Sie durch die Welt der erstaunlichen Wissenschaft – der Molekularbiologie! Wir beginnen mit einem historischen Ausflug durch die Phasen seiner Entwicklung und beschreiben die wichtigsten Entdeckungen und Experimente seit 1933. Und wir werden auch die wichtigsten Methoden der Molekularbiologie anschaulich beschreiben, die es ermöglichten, Gene zu manipulieren, zu verändern und zu isolieren. Die Entstehung dieser Methoden war ein starker Impuls für die Entwicklung der Molekularbiologie. Und erinnern wir uns auch an die Rolle der Biotechnologie und sprechen eines der beliebtesten Themen in diesem Bereich an – die Bearbeitung des Genoms mithilfe von CRISPR/Cas-Systemen.

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1. Einleitung. Essenz der Molekularbiologie

Es untersucht die Grundlagen der lebenswichtigen Aktivität von Organismen auf der Ebene von Makromolekülen. Ziel der Molekularbiologie ist es, auf der Grundlage des Wissens über ihre Strukturen und Eigenschaften die Rolle und Funktionsweise dieser Makromoleküle aufzuklären.

Historisch gesehen entstand die Molekularbiologie während der Entwicklung von Bereichen der Biochemie, die Nukleinsäuren und Proteine ​​untersuchen. Während die Biochemie den Stoffwechsel, die chemische Zusammensetzung lebender Zellen und Organismen sowie die in ihnen ablaufenden chemischen Prozesse untersucht, konzentriert sich die Molekularbiologie auf die Untersuchung der Mechanismen der Übertragung, Reproduktion und Speicherung genetischer Informationen.

Und Gegenstand des Studiums der Molekularbiologie sind die Nukleinsäuren selbst – Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA) – und Proteine ​​sowie ihre makromolekularen Komplexe – Chromosomen, Ribosomen, Multienzymsysteme, die die Biosynthese von Proteinen und Nukleinsäuren ermöglichen. Auch die Molekularbiologie grenzt an die Untersuchungsgegenstände und deckt sich teilweise mit der Molekulargenetik, der Virologie, der Biochemie und einer Reihe anderer verwandter biologischer Wissenschaften.

2. Historischer Ausflug durch die Entwicklungsstadien der Molekularbiologie

Als eigenständiger Bereich der Biochemie begann sich die Molekularbiologie in den 30er Jahren des letzten Jahrhunderts zu entwickeln. Schon damals wurde es notwendig, das Phänomen Leben auf molekularer Ebene zu verstehen, um die Prozesse der Übertragung und Speicherung genetischer Informationen zu untersuchen. Gerade zu dieser Zeit wurde die Aufgabe der Molekularbiologie in der Untersuchung der Eigenschaften, Struktur und Wechselwirkung von Proteinen und Nukleinsäuren begründet.

Der Begriff „Molekularbiologie“ wurde erstmals verwendet 1933 Jahr William Astbury während der Untersuchung fibrillärer Proteine ​​(Kollagen, Blutfibrin, kontraktile Muskelproteine). Astbury untersuchte den Zusammenhang zwischen der molekularen Struktur und den biologischen, physikalischen Eigenschaften dieser Proteine. Zu Beginn der Molekularbiologie galt RNA nur als Bestandteil von Pflanzen und Pilzen und DNA nur als Bestandteil von Tieren. Und in 1935 Die Entdeckung der Erbsen-DNA durch Andrei Belozersky führte zur Feststellung, dass DNA in jeder lebenden Zelle enthalten ist.

IN 1940 Eine kolossale Leistung war die Feststellung eines kausalen Zusammenhangs zwischen Genen und Proteinen durch George Beadle und Edward Tatham. Die Hypothese der Wissenschaftler „Ein Gen – ein Enzym“ bildete die Grundlage für das Konzept, dass die spezifische Struktur eines Proteins durch Gene reguliert wird. Es wird angenommen, dass genetische Informationen durch eine spezielle Nukleotidsequenz in der DNA kodiert werden, die die Primärstruktur von Proteinen reguliert. Später wurde nachgewiesen, dass viele Proteine ​​eine Quartärstruktur haben. An der Bildung solcher Strukturen sind verschiedene Peptidketten beteiligt. Auf dieser Grundlage wurde die Bestimmung über die Beziehung zwischen einem Gen und einem Enzym etwas geändert und klingt jetzt wie „Ein Gen – ein Polypeptid“.

IN 1944 Im Jahr 1999 bewiesen der amerikanische Biologe Oswald Avery und seine Kollegen (Colin McLeod und McLean McCarthy), dass die Substanz, die die Transformation von Bakterien verursacht, DNA und nicht Proteine ​​ist. Das Experiment diente als Beweis für die Rolle der DNA bei der Übertragung erblicher Informationen und löschte veraltetes Wissen über die Proteinnatur von Genen aus.

In den frühen 1950er Jahren zeigte Frederick Sanger, dass eine Proteinkette eine einzigartige Abfolge von Aminosäureresten ist. IN 1951 Und 1952 Jahrelang bestimmte der Wissenschaftler die vollständige Sequenz zweier Polypeptidketten – Rinderinsulin IN(30 Aminosäurereste) und A(21 Aminosäurereste).

Ungefähr zur gleichen Zeit, in 1951–1953 Erwin Chargaff formulierte die Regeln für das Verhältnis stickstoffhaltiger Basen in der DNA. Gemäß der Regel ist unabhängig von den Artenunterschieden lebender Organismen in ihrer DNA die Menge an Adenin (A) gleich der Menge an Thymin (T) und die Menge an Guanin (G) ist gleich der Menge an Cytosin (C).

IN 1953 bewies die genetische Rolle der DNA. James Watson und Francis Crick stellten auf der Grundlage der von Rosalind Franklin und Maurice Wilkins erhaltenen Röntgenaufnahmen der DNA die räumliche Struktur der DNA fest und stellten eine später bestätigte Annahme über den Mechanismus ihrer Replikation (Verdoppelung) auf, der der Vererbung zugrunde liegt.

1958 Jahr - die Bildung des zentralen Dogmas der Molekularbiologie durch Francis Crick: Die Übertragung genetischer Informationen erfolgt in Richtung DNA → RNA → Protein.

Der Kern des Dogmas besteht darin, dass es in Zellen einen bestimmten gerichteten Informationsfluss aus der DNA gibt, die wiederum der ursprüngliche genetische Text ist, der aus vier Buchstaben besteht: A, T, G und C. Er ist in die DNA geschrieben Doppelhelix in Form von Sequenzen dieser Buchstaben - Nukleotide.

Dieser Text wird transkribiert. Und der Prozess wird aufgerufen Transkription. Bei diesem Prozess wird RNA synthetisiert, die mit dem genetischen Text identisch ist, jedoch mit einem Unterschied: In der RNA befindet sich anstelle von T U (Uracil).

Diese RNA heißt Boten-RNA (mRNA), oder Matrix (mRNA). Übertragen mRNA wird unter Verwendung des genetischen Codes in Form von Triplettsequenzen von Nukleotiden ausgeführt. Während dieses Prozesses wird der Text der DNA- und RNA-Nukleinsäuren von einem Text mit vier Buchstaben in einen Text mit zwanzig Buchstaben aus Aminosäuren übersetzt.

Es gibt nur zwanzig natürliche Aminosäuren und der Text von Nukleinsäuren besteht aus vier Buchstaben. Aus diesem Grund erfolgt durch den genetischen Code eine Übersetzung vom Vier-Buchstaben-Alphabet zum Zwanzig-Buchstaben-Alphabet, in dem jeweils drei Nukleotide einer Aminosäure entsprechen. Man kann also aus vier Buchstaben ganze 64 Drei-Buchstaben-Kombinationen bilden, außerdem sind es 20 Aminosäuren. Daraus folgt, dass der genetische Code zwangsläufig die Eigenschaft der Degeneration aufweisen muss. Allerdings war der genetische Code zu diesem Zeitpunkt noch nicht bekannt, außerdem hatte man noch nicht einmal damit begonnen, ihn zu entschlüsseln, aber Crick hatte sein zentrales Dogma bereits formuliert.

Dennoch bestand die Gewissheit, dass der Code existieren musste. Zu diesem Zeitpunkt war bewiesen, dass dieser Code einen Triplettcharakter hatte. Dies bedeutet, dass speziell drei Buchstaben in Nukleinsäuren ( Codons) entsprechen einer beliebigen Aminosäure. Es gibt 64 dieser Codons, sie kodieren für 20 Aminosäuren. Das bedeutet, dass jede Aminosäure mehreren Codons gleichzeitig entspricht.

Daraus können wir schließen, dass das zentrale Dogma ein Postulat ist, das besagt, dass in der Zelle ein gerichteter Informationsfluss stattfindet: DNA → RNA → Protein. Crick betonte den Hauptinhalt des zentralen Dogmas: Der umgekehrte Informationsfluss kann nicht stattfinden, das Protein ist nicht in der Lage, genetische Informationen zu verändern.

Dies ist die Hauptbedeutung des zentralen Dogmas: Ein Protein ist nicht in der Lage, Informationen in DNA (oder RNA) zu verändern und umzuwandeln, der Fluss geht immer nur in eine Richtung.

Einige Zeit später wurde ein neues Enzym entdeckt, das zum Zeitpunkt der Formulierung des zentralen Dogmas noch nicht bekannt war: umgekehrte Transkriptase das DNA aus RNA synthetisiert. Das Enzym wurde in Viren entdeckt, bei denen die genetische Information in RNA und nicht in DNA kodiert ist. Solche Viren werden Retroviren genannt. Sie verfügen über eine Viruskapsel mit darin eingeschlossener RNA und einem speziellen Enzym. Das Enzym ist eine Reverse Transkriptase, die nach der Vorlage dieser viralen RNA DNA synthetisiert und diese DNA dann als genetisches Material für die weitere Entwicklung des Virus in der Zelle dient.

Natürlich löste diese Entdeckung unter Molekularbiologen großen Schock und große Kontroversen aus, da man glaubte, dass dies aufgrund des zentralen Dogmas nicht der Fall sein könne. Crick erklärte jedoch sofort, dass er nie gesagt habe, dass es unmöglich sei. Er sagte nur, dass es niemals einen Informationsfluss vom Protein zu Nukleinsäuren geben kann und dass bereits innerhalb von Nukleinsäuren alle Arten von Prozessen durchaus möglich sind: die Synthese von DNA auf DNA, DNA auf RNA, RNA auf DNA und RNA auf RNA.

Nach der Formulierung des zentralen Dogmas blieben noch eine Reihe von Fragen offen: Wie kodiert das Alphabet aus vier Nukleotiden, aus denen DNA (oder RNA) besteht, das 20-Buchstaben-Alphabet aus Aminosäuren, aus denen Proteine ​​bestehen? Was ist die Essenz des genetischen Codes?

Die ersten Ideen zur Existenz des genetischen Codes wurden von Alexander Downes formuliert ( 1952 d.) und Georgy Gamov ( 1954 G.). Wissenschaftler haben gezeigt, dass die Nukleotidsequenz mindestens drei Verknüpfungen enthalten muss. Später wurde bewiesen, dass eine solche Sequenz aus drei sogenannten Nukleotiden besteht Codon (Triplett). Allerdings blieb die Frage, welche Nukleotide für den Einbau welcher Aminosäure in ein Proteinmolekül verantwortlich sind, bis 1961 offen.

Und in 1961 Marschall Nirenberg nutzte das System zusammen mit Heinrich Mattei zum Senden in vitro. Als Vorlage wurde ein Oligonukleotid verwendet. Es enthielt nur Uracilreste und das daraus synthetisierte Peptid enthielt nur die Aminosäure Phenylalanin. Damit wurde erstmals die Bedeutung des Codons geklärt: Das Codon UUU kodiert für Phenylalanin. Später fand der Koran heraus, dass die Nukleotidsequenz UCUCUCUCUCUC eine Reihe von Aminosäuren Serin-Leucin-Serin-Leucin kodiert. Im Großen und Ganzen dank der Werke von Nirenberg und dem Koran 1965 Jahr wurde der genetische Code vollständig entschlüsselt. Es stellte sich heraus, dass jedes Triplett eine bestimmte Aminosäure kodiert. Und die Reihenfolge der Codons bestimmt die Reihenfolge der Aminosäuren im Protein.

Die Grundprinzipien der Funktionsweise von Proteinen und Nukleinsäuren wurden Anfang der 70er Jahre formuliert. Es wurde festgestellt, dass die Synthese von Proteinen und Nukleinsäuren nach dem Matrixmechanismus erfolgt. Das Matrizenmolekül trägt verschlüsselte Informationen über die Sequenz von Aminosäuren oder Nukleotiden. Bei der Replikation oder Transkription handelt es sich bei der Matrize um DNA, bei der Translation und reversen Transkription um mRNA.

Damit wurden die Voraussetzungen für die Ausbildung molekularbiologischer Gebiete einschließlich der Gentechnik geschaffen. Und 1972 entwickelten Paul Berg und Kollegen die Technologie des molekularen Klonens. Wissenschaftler haben die erste rekombinante DNA erhalten in vitro. Diese herausragenden Entdeckungen bildeten die Grundlage für eine neue Richtung in der Molekularbiologie 1972 Das Jahr gilt seitdem als Geburtsdatum der Gentechnik.

3. Methoden der Molekularbiologie

Enorme Fortschritte bei der Untersuchung von Nukleinsäuren, der Struktur der DNA und der Proteinbiosynthese haben zur Entwicklung einer Reihe von Methoden von großer Bedeutung in der Medizin, Landwirtschaft und Wissenschaft im Allgemeinen geführt.

Nach dem Studium des genetischen Codes und der Grundprinzipien der Speicherung, Übertragung und Umsetzung von Erbinformationen wurden spezielle Methoden für die Weiterentwicklung der Molekularbiologie notwendig. Mit diesen Methoden könnten Gene manipuliert, verändert und isoliert werden.

Die Entstehung solcher Methoden erfolgte in den 1970er und 1980er Jahren. Dies gab der Entwicklung der Molekularbiologie enorme Impulse. Diese Methoden stehen zunächst in direktem Zusammenhang mit der Produktion von Genen und deren Einführung in die Zellen anderer Organismen sowie der Möglichkeit, die Nukleotidsequenz in Genen zu bestimmen.

3.1. DNA-Elektrophorese

DNA-Elektrophorese ist die grundlegende Methode der Arbeit mit DNA. Die DNA-Elektrophorese wird zusammen mit fast allen anderen Methoden verwendet, um die gewünschten Moleküle zu isolieren und die Ergebnisse weiter zu analysieren. Die Gelelektrophorese-Methode selbst dient der Längentrennung von DNA-Fragmenten.

Vor oder nach der Elektrophorese wird das Gel mit Farbstoffen behandelt, die an DNA binden können. Die Farbstoffe fluoreszieren im ultravioletten Licht, was zu einem Bandenmuster im Gel führt. Um die Länge von DNA-Fragmenten zu bestimmen, können diese verglichen werden Markierungen- Sätze von Fragmenten mit Standardlängen, die auf dasselbe Gel aufgetragen werden.

Fluoreszierende Proteine

Bei der Untersuchung eukaryotischer Organismen bietet es sich an, fluoreszierende Proteine ​​als Markergene zu verwenden. Das Gen für das erste grün fluoreszierende Protein ( grün fluoreszierendes Protein, GFP) aus Quallen isoliert Aqeuorea Victoria und dann in verschiedene Organismen eingeführt. Danach wurden Gene für fluoreszierende Proteine ​​anderer Farben isoliert: blau, gelb, rot. Um Proteine ​​mit interessanten Eigenschaften zu erhalten, wurden solche Gene künstlich verändert.

Im Allgemeinen sind die wichtigsten Werkzeuge für die Arbeit mit dem DNA-Molekül Enzyme, die eine Reihe von DNA-Transformationen in Zellen durchführen: DNA-Polymerase, DNA-Ligasen Und Einschränkungen (Restriktionsendonukleasen).

Transgenese

Transgenese Man nennt es die Übertragung von Genen von einem Organismus auf einen anderen. Solche Organismen werden genannt transgen.

Rekombinante Proteinpräparate werden einfach durch die Übertragung von Genen in Mikroorganismenzellen gewonnen. Die meisten dieser Proteine ​​sind Interferone, Insulin, einige Proteinhormone sowie Proteine ​​zur Herstellung einer Reihe von Impfstoffen.

In anderen Fällen werden Zellkulturen von Eukaryoten oder transgenen Tieren, meist Nutztieren, verwendet, die die notwendigen Proteine ​​in die Milch absondern. Auf diese Weise werden Antikörper, Blutgerinnungsfaktoren und andere Proteine ​​gewonnen. Mit der Transgenese-Methode werden Pflanzen gewonnen, die gegen Schädlinge und Herbizide resistent sind, und das Abwasser wird mit Hilfe transgener Mikroorganismen gereinigt.

Darüber hinaus sind transgene Technologien in der wissenschaftlichen Forschung unverzichtbar, da die Entwicklung der Biologie durch den Einsatz von Genmodifikations- und Transfermethoden schneller erfolgt.

Einschränkungen

Die von Restriktionsenzymen erkannten Sequenzen sind symmetrisch, sodass jede Art von Brüchen entweder in der Mitte einer solchen Sequenz oder mit einer Verschiebung in einem oder beiden Strängen des DNA-Moleküls auftreten kann.

Bei der Spaltung einer DNA mit einem Restriktionsenzym sind die Sequenzen an den Enden der Fragmente gleich. Sie können sich wieder vernetzen, da sie über ergänzende Websites verfügen.

Sie können ein einzelnes Molekül erhalten, indem Sie diese Sequenzen zusammenfügen DNA-Ligasen. Dadurch ist es möglich, Fragmente zweier unterschiedlicher DNA zu kombinieren und rekombinante DNA zu erhalten.

3.2. PCR

Die Methode basiert auf der Fähigkeit von DNA-Polymerasen, den zweiten DNA-Strang entlang des komplementären Strangs auf die gleiche Weise zu vervollständigen wie beim Prozess der DNA-Replikation in einer Zelle.

3.3. DNA-Sequenzierung

Die schnelle Entwicklung der Sequenzierungsmethode ermöglicht es, die Eigenschaften des untersuchten Organismus auf der Ebene seines Genoms effektiv zu bestimmen. Der Hauptvorteil solcher genomischer und postgenomischer Technologien besteht in der Erweiterung der Möglichkeiten zur Erforschung und Untersuchung der genetischen Natur menschlicher Krankheiten, um die notwendigen Maßnahmen im Voraus zu ergreifen und Krankheiten zu vermeiden.

Durch groß angelegte Forschung ist es möglich, die notwendigen Daten über die verschiedenen genetischen Merkmale verschiedener Personengruppen zu erhalten und so die Methoden der Medizin zu entwickeln. Aus diesem Grund erfreut sich die Identifizierung einer genetischen Veranlagung für verschiedene Krankheiten heute großer Beliebtheit.

Ähnliche Methoden sind praktisch überall auf der Welt weit verbreitet, auch in Russland. Aufgrund des wissenschaftlichen Fortschritts kommt es zu einer Einführung solcher Methoden in die medizinische Forschung und die medizinische Praxis im Allgemeinen.

4. Biotechnologie

Biotechnologie- eine Disziplin, die die Möglichkeiten untersucht, lebende Organismen oder ihre Systeme zur Lösung technologischer Probleme zu nutzen und durch Gentechnik lebende Organismen mit den gewünschten Eigenschaften zu schaffen. Die Biotechnologie wendet Methoden der Chemie, Mikrobiologie, Biochemie und natürlich der Molekularbiologie an.

Die Hauptrichtungen der Entwicklung der Biotechnologie (die Prinzipien biotechnologischer Prozesse werden in die Produktion aller Industrien eingeführt):

1. Schaffung und Produktion neuartiger Lebens- und Futtermittel.
2. Gewinnung und Untersuchung neuer Mikroorganismenstämme.
3. Züchtung neuer Pflanzensorten sowie Schaffung von Mitteln zum Schutz von Pflanzen vor Krankheiten und Schädlingen.
4. Anwendung biotechnologischer Methoden für die Bedürfnisse der Ökologie. Solche biotechnologischen Methoden werden zur Abfallverwertung, Abwasserbehandlung, Abluft- und Bodensanierung eingesetzt.
5. Herstellung von Vitaminen, Hormonen, Enzymen, Seren für den medizinischen Bedarf. Biotechnologen entwickeln sich verbessert Medikamente galt bisher als unheilbar.

Eine große Errungenschaft der Biotechnologie ist die Gentechnik.

Gentechnik- eine Reihe von Technologien und Methoden zur Gewinnung rekombinanter RNA- und DNA-Moleküle, zur Isolierung einzelner Gene aus Zellen, zur Manipulation von Genen und deren Einführung in andere Organismen (Bakterien, Hefen, Säugetiere). Solche Organismen sind in der Lage, Endprodukte mit den gewünschten, veränderten Eigenschaften herzustellen.

Gentechnische Methoden zielen darauf ab, neue, bisher in der Natur nicht existierende Kombinationen von Genen zu konstruieren.

Wenn man über die Errungenschaften der Gentechnik spricht, kommt man nicht umhin, das Thema Klonen anzusprechen. Klonen ist eine der Methoden der Biotechnologie, mit der durch ungeschlechtliche Fortpflanzung identische Nachkommen verschiedener Organismen erzeugt werden.

Mit anderen Worten kann man sich Klonen als den Prozess der Erstellung genetisch identischer Kopien eines Organismus oder einer Zelle vorstellen. Und geklonte Organismen sind nicht nur in ihren äußeren Merkmalen, sondern auch im genetischen Inhalt ähnlich oder völlig identisch.

Das berüchtigte Schaf Dolly wurde 1966 das erste geklonte Säugetier. Es wurde durch Transplantation des Kerns einer somatischen Zelle in das Zytoplasma der Eizelle gewonnen. Dolly war eine genetische Kopie des Kernspenderschafs. Unter natürlichen Bedingungen entsteht ein Individuum aus einer befruchteten Eizelle, die die Hälfte des genetischen Materials von zwei Elternteilen erhalten hat. Beim Klonen wurde jedoch das genetische Material aus der Zelle eines Individuums entnommen. Zunächst wurde der Zygote der Zellkern entnommen, der die DNA selbst enthält. Dann entfernten sie den Zellkern aus der erwachsenen Schafszelle und implantierten ihn in diese Zygote ohne Zellkern. Anschließend wurde er in die Gebärmutter eines Erwachsenen transplantiert, wo er wachsen und sich entwickeln konnte.

Allerdings waren nicht alle Klonversuche erfolgreich. Parallel zum Klonen von Dolly wurde ein DNA-Ersatzexperiment an 273 anderen Eiern durchgeführt. Aber nur in einem Fall konnte sich ein lebendes erwachsenes Tier vollständig entwickeln und wachsen. Nach Dolly versuchten Wissenschaftler, andere Säugetierarten zu klonen.

Eine der Arten der Gentechnik ist Genombearbeitung.

Das CRISPR/Cas-Tool basiert auf einem Element des Immunabwehrsystems von Bakterien, das Wissenschaftler angepasst haben, um jegliche Veränderungen in der DNA von Tieren oder Pflanzen herbeizuführen.

CRISPR/Cas gehört zu den biotechnologischen Methoden zur Manipulation einzelner Gene in Zellen. Es gibt viele Anwendungen für diese Technologie. CRISPR/Cas ermöglicht es Forschern, die Funktion verschiedener Gene herauszufinden. Dazu müssen Sie lediglich das zu untersuchende Gen aus der DNA herausschneiden und untersuchen, welche Körperfunktionen betroffen sind.

Manche praktische Anwendungen Systeme:

1. Landwirtschaft. Durch CRISPR/Cas-Systeme können Ernten verbessert werden. Nämlich, um sie schmackhafter und nahrhafter sowie hitzebeständiger zu machen. Es ist möglich, Pflanzen mit anderen Eigenschaften auszustatten: zum Beispiel das Herausschneiden eines Allergengens aus Nüssen (Erdnüssen oder Haselnüssen).
2. Medizin, Erbkrankheiten. Wissenschaftler haben das Ziel, mit CRISPR/Cas Mutationen aus dem menschlichen Genom zu entfernen, die Krankheiten wie Sichelzellenanämie usw. verursachen können. Theoretisch kann CRISPR/Cas die Entwicklung von HIV stoppen.
3. Gene Drive. CRISPR/Cas kann nicht nur das Genom eines einzelnen Tieres oder einer einzelnen Pflanze, sondern auch den Genpool einer Art verändern. Dieses Konzept ist bekannt als „Gene Drive“. Jeder lebende Organismus gibt die Hälfte seiner Gene an seine Nachkommen weiter. Doch der Einsatz von CRISPR/Cas kann die Wahrscheinlichkeit eines Gentransfers um bis zu 100 % erhöhen. Dies ist wichtig, damit sich das gewünschte Merkmal schneller in der Population verbreiten kann.

Schweizer Wissenschaftler haben die Genomeditierungsmethode CRISPR/Cas deutlich verbessert und modernisiert und damit ihre Möglichkeiten erweitert. Mit dem CRISPR/Cas-System konnten Wissenschaftler jedoch jeweils nur ein Gen verändern. Doch nun haben Forschende der ETH Zürich eine Methode entwickelt, mit der sich 25 Gene in einer Zelle gleichzeitig verändern lassen.

Für die neueste Technik verwendeten Experten das Enzym Cas12a. Genetiker haben zum ersten Mal in der Geschichte erfolgreich Affen geklont. „Beliebte Mechanik“;

Nikolenko S. (2012). Genomik: Problemstellung und Sequenzierungsmethoden. „Post-Wissenschaft“.

Molekularbiologie, eine Wissenschaft, deren Aufgabe es ist, die Natur von Lebensphänomenen zu kennen, indem sie biologische Objekte und Systeme auf einer Ebene untersucht, die sich der molekularen Ebene nähert und in einigen Fällen diese Grenze erreicht. Das ultimative Ziel besteht hierbei darin, zu klären, wie und in welchem ​​Umfang die charakteristischen Erscheinungsformen des Lebens, wie Vererbung, Fortpflanzung der eigenen Art, Proteinbiosynthese, Erregbarkeit, Wachstum und Entwicklung, Speicherung und Übertragung von Informationen, Energieumwandlungen, Mobilität, usw. sind auf die Struktur, Eigenschaften und Wechselwirkung von Molekülen biologisch wichtiger Substanzen zurückzuführen, vor allem der beiden Hauptklassen hochmolekularer Biopolymere – Proteine ​​und Nukleinsäuren. Eine Besonderheit von M. b. - das Studium der Lebensphänomene an unbelebten Objekten oder solchen, die durch die primitivsten Erscheinungsformen des Lebens gekennzeichnet sind. Dies sind biologische Gebilde ab der zellulären Ebene und darunter: subzelluläre Organellen, wie isolierte Zellkerne, Mitochondrien, Ribosomen, Chromosomen, Zellmembranen; weiter - Systeme, die an der Grenze zwischen belebter und unbelebter Natur stehen - Viren, einschließlich Bakteriophagen, und endend mit den Molekülen der wichtigsten Bestandteile lebender Materie - Nukleinsäuren und Proteine.

Den Grundstein für die Entwicklung von M. legten Wissenschaften wie Genetik, Biochemie, Physiologie elementarer Prozesse usw. Nach den Ursprüngen seiner Entwicklung war M. b. ist untrennbar mit der Molekulargenetik verbunden, die nach wie vor ein wichtiger Teil davon ist

Eine Besonderheit von M. b. ist seine Dreidimensionalität. Die Essenz von M. b. M. Perutz sieht es darin, biologische Funktionen anhand der molekularen Struktur zu interpretieren. M. b. zielt darauf ab, Antworten auf die Frage „Wie“ zu erhalten, indem man das Wesen der Rolle und Beteiligung der gesamten Struktur des Moleküls kennt, und auf die Fragen „Warum“ und „Warum“, indem man einerseits die Beziehung herausfindet zwischen den Eigenschaften des Moleküls (wiederum hauptsächlich Proteine ​​und Nukleinsäuren) und den von ihm ausgeübten Funktionen und andererseits der Rolle dieser einzelnen Funktionen im Gesamtkomplex der Manifestationen lebenswichtiger Aktivität.

Die wichtigsten Errungenschaften der Molekularbiologie. Hier ist eine bei weitem nicht vollständige Liste dieser Errungenschaften: Offenlegung der Struktur und des Mechanismus der biologischen Funktion von DNA, aller Arten von RNA und Ribosomen, Offenlegung des genetischen Codes; Entdeckung der Reverse Transkription, d. h. der DNA-Synthese auf einer RNA-Matrize; Untersuchung der Funktionsmechanismen von Atemwegspigmenten; Entdeckung der dreidimensionalen Struktur und ihrer funktionellen Rolle bei der Wirkung von Enzymen, des Prinzips der Matrixsynthese und der Mechanismen der Proteinbiosynthese; Offenlegung der Struktur von Viren und der Mechanismen ihrer Replikation, der primären und teilweise der räumlichen Struktur von Antikörpern; Isolierung einzelner Gene, chemische und anschließend biologische (enzymatische) Gensynthese, auch beim Menschen, außerhalb der Zelle (in vitro); Übertragung von Genen von einem Organismus auf einen anderen, auch in menschliche Zellen; die rasch voranschreitende Entschlüsselung der chemischen Struktur einer zunehmenden Zahl einzelner Proteine, vor allem Enzyme, sowie Nukleinsäuren; Entdeckung der Phänomene der „Selbstorganisation“ einiger biologischer Objekte von immer größerer Komplexität, angefangen bei Nukleinsäuremolekülen bis hin zu Mehrkomponentenenzymen, Viren, Ribosomen usw.; Aufklärung allosterischer und anderer Grundprinzipien der Regulierung biologischer Funktionen und Prozesse.

Probleme der Molekularbiologie. Neben den genannten wichtigen Aufgaben würde M. (Kenntnis der Gesetze der „Erkennung“, Selbstorganisation und Integration) Die eigentliche Richtung der wissenschaftlichen Suche für die nahe Zukunft ist die Entwicklung von Methoden, die es ermöglichen, die Struktur und dann die dreidimensionale, räumliche Organisation hochmolekularer Stoffe zu entschlüsseln Nukleinsäuren. Alle wichtigen Methoden, deren Einsatz die Entstehung und den Erfolg von M. b. sicherte, wurden von Physikern vorgeschlagen und entwickelt (Ultrazentrifugation, Röntgenbeugungsanalyse, Elektronenmikroskopie, Kernspinresonanz usw.). Fast alle neuen physikalischen Versuchsansätze (zum Beispiel der Einsatz von Computern, Synchrotron- oder Bremsstrahlung, Lasertechnik etc.) eröffnen neue Möglichkeiten für vertiefendes Studium Probleme M. b. Zu den wichtigsten Aufgaben praktischer Natur, deren Beantwortung von M. b. erwartet wird, gehört in erster Linie das Problem molekulare Grundlagen bösartiges Wachstum also - Möglichkeiten zur Vorbeugung und möglicherweise zur Überwindung von Erbkrankheiten - "molekulare Krankheiten". Von großer Bedeutung wird die Aufklärung der molekularen Grundlagen der biologischen Katalyse sein, also der Wirkung von Enzymen. Zu den wichtigsten modernen Richtungen von M. b. sollte den Wunsch beinhalten, die molekularen Wirkmechanismen von Hormonen, toxischen und medizinischen Substanzen zu entschlüsseln sowie die Details der molekularen Struktur und Funktionsweise solcher zellulärer Strukturen wie biologischer Membranen herauszufinden, die an der Regulierung der Penetrationsprozesse beteiligt sind und Transport von Stoffen. Entferntere Ziele M. b. - Kenntnisse über die Natur nervöser Prozesse, Gedächtnismechanismen usw. Einer der wichtigen aufstrebenden Abschnitte von M. b. - sogenannt. Gentechnik, deren Aufgabe es ist, den genetischen Apparat (Genom) lebender Organismen gezielt zu betreiben, angefangen bei Mikroben und niederen (einzelligen) bis hin zum Menschen (im letzteren Fall hauptsächlich zum Zweck der radikalen Behandlung von Erbkrankheiten und Korrektur genetischer Defekte).

Die wichtigsten Richtungen des MB:

- Molekulargenetik – das Studium der strukturellen und funktionellen Organisation des genetischen Apparats der Zelle und des Mechanismus zur Umsetzung erblicher Informationen

– Molekulare Virologie – die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Interaktion von Viren mit Zellen

– Molekulare Immunologie – die Untersuchung der Muster von Immunreaktionen des Körpers

– Molekularbiologie der Entwicklung – die Untersuchung des Auftretens der Zellvielfalt im Verlauf der individuellen Entwicklung von Organismen und der Spezialisierung von Zellen

Hauptforschungsgegenstände: Viren (einschließlich Bakteriophagen), Zellen und subzelluläre Strukturen, Makromoleküle, mehrzellige Organismen.

Molekularbiologie / mə lɛ ZuJʊ lähm / ist ein Zweig der Biologie, der sich mit den molekularen Grundlagen der biologischen Aktivität zwischen Biomolekülen in verschiedenen Zellsystemen befasst, einschließlich Wechselwirkungen zwischen DNA, RNA, Proteinen und deren Biosynthese sowie der Regulierung dieser Wechselwirkungen. Aufnahme in Natur 1961 beschrieb Astbury die Molekularbiologie:

Weniger eine Technik als vielmehr ein Ansatz, ein Ansatz aus der Sicht der sogenannten Grundlagenwissenschaften mit der Leitidee, unterhalb der großräumigen Erscheinungsformen der klassischen Biologie nach dem entsprechenden molekularen Plan zu suchen. Dabei geht es insbesondere um Formen biologische Moleküle und überwiegend dreidimensional und strukturell - was jedoch nicht bedeutet, dass es sich hierbei nur um eine Verfeinerung der Morphologie handelt. Er muss gleichzeitig Genese und Funktion untersuchen.

Beziehung zu anderen biologischen Wissenschaften

Forscher auf dem Gebiet der Molekularbiologie nutzen die spezifischen Methoden der wachsenden Molekularbiologie, kombinieren sie jedoch zunehmend mit Methoden und Ideen aus der Genetik und Biochemie. Es gibt keine definierte Grenze zwischen diesen Disziplinen. Dies wird im folgenden Diagramm dargestellt, das eine mögliche Art der Beziehung zwischen Feldern darstellt:

• Biochemie ist die Untersuchung von Chemikalien und lebenswichtigen Prozessen, die in lebenden Organismen ablaufen. Biochemikern fällt es schwer, sich auf die Rolle, Funktion und Struktur von Biomolekülen zu konzentrieren. Das Studium der Chemie hinter biologischen Prozessen und die Synthese biologisch aktiver Moleküle sind Beispiele für Biochemie.
• Genetik ist die Untersuchung des Einflusses genetischer Unterschiede in Organismen. Dies lässt sich häufig auf das Fehlen einer normalen Komponente (z. B. eines einzelnen Gens) schließen. Die Untersuchung von „Mutanten“ – Organismen, die eine oder mehrere funktionelle Komponenten im Vergleich zum sogenannten „Wildtyp“ oder normalen Phänotyp aufweisen. Genetische Interaktionen (Epistase) werden durch einfache Interpretationen solcher „Knockout“-Studien oft verwechselt.
• Molekularbiologie ist die Untersuchung der molekularen Grundlagen der Prozesse der Replikation, Transkription, Translation und Zellfunktion. Das zentrale Dogma der Molekularbiologie, bei dem genetisches Material in RNA transkribiert und dann in Protein übersetzt wird, bietet trotz seiner Vereinfachung immer noch einen guten Ausgangspunkt für das Verständnis des Fachgebiets. Das Bild wurde angesichts der sich abzeichnenden neuen Rollen der RNA überarbeitet.

Methoden der Molekularbiologie

Molekulares Klonen

Eine der grundlegendsten molekularbiologischen Techniken zur Untersuchung der Funktion eines Proteins ist das molekulare Klonen. Bei dieser Technik wird die DNA, die das Protein von Interesse kodiert, mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder Restriktionsenzymen in ein Plasmid (einen Expressionsvektor) kloniert. Der Vektor weist drei Unterscheidungsmerkmale auf: einen Replikationsursprung, eine multiple Klonierungsstelle (MCS) und einen selektierbaren Marker, normalerweise mit Antibiotikaresistenz. Die stromaufwärts gelegenen multiplen Klonierungsstellen sind die Regionen des Promotors und der Transkriptionsstartstelle, die die Expression des klonierten Gens regulieren. Dieses Plasmid kann entweder in bakterielle oder tierische Zellen eingefügt werden. Einführung von DNA in Bakterienzellen kann durch nackte DNA-Aufnahmetransformation, Zell-zu-Zell-Konjugationen oder durch Transduktion mit einem viralen Vektor erfolgen. Das Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen, beispielsweise tierische Zellen, auf physikalischem oder chemischem Wege wird als Transfektion bezeichnet. Es stehen verschiedene Transfektionsmethoden zur Verfügung, wie z. B. Calciumphosphat-Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion und liposomale Transfektion. Das Plasmid kann in das Genom integriert werden, was zu einer stabilen Transfektion führt, oder es kann unabhängig vom Genom bleiben, was als Transfektionstransienten bezeichnet wird.

Die DNA, die die Proteine ​​von Interesse codiert, befindet sich nun in der Zelle und die Proteine ​​können nun exprimiert werden. Verschiedene Systeme wie induzierbare Promotoren und spezifische Zellsignalfaktoren tragen dazu bei, Proteininteresse in hohem Maße auszudrücken. Anschließend können große Mengen des Proteins aus der Bakterien- oder Eukaryontenzelle extrahiert werden. Das Protein kann unter verschiedenen Bedingungen auf enzymatische Aktivität getestet werden, das Protein kann kristallisiert werden, um seine Tertiärstruktur zu untersuchen, oder in der pharmazeutischen Industrie kann die Aktivität neuer Arzneimittel gegen das Protein untersucht werden.

Polymerase Kettenreaktion

Makromolekül-Blotting und -Untersuchung

Bedingungen nördlich , Westen Und orientalisch Blotting geht auf einen ursprünglich molekularbiologischen Witz zurück, der sich auf diesen Begriff bezieht Southernnet, nach der von Edwin Southern für die BLOTTED-DNA-Hybridisierung beschriebenen Technik. Patricia Thomas, Entwicklerin des RNA-Blottings, die damals bekannt wurde als nördlich - Blotting, verwenden Sie den Begriff eigentlich nicht.

Southern Blot

Der nach seinem Erfinder, dem Biologen Edwin Southern, benannte Southern Blot ist eine Technik zur Untersuchung des Vorhandenseins einer bestimmten DNA-Sequenz in einer DNA-Probe. DNA-Proben vor oder nach Restriktionsenzym-(Restriktionsenzym)-Verdauungen werden durch Gelelektrophorese aufgetrennt und dann durch Kapillarblotting auf die Membran übertragen. Die Membran wird dann einer markierten DNA-Sonde ausgesetzt, deren Basensequenz komplementär zu der Basensequenz der interessierenden DNA ist. Southern Blot wird im wissenschaftlichen Labor weniger häufig eingesetzt, da andere Methoden wie die PCR in der Lage sind, spezifische DNA-Sequenzen aus DNA-Proben nachzuweisen. Diese Blots werden jedoch immer noch für einige Anwendungen verwendet, beispielsweise zur Messung der Transgenkopienzahl in transgenen Mäusen oder bei der Entwicklung von Gen-Knockout-Linien embryonaler Stammzellen.

Northern-Blotting

Northern-Blot-Diagramm

East-Blotting

Klinische Forschung und medizinische Therapien aus der Molekularbiologie werden teilweise von der Gentherapie abgedeckt. Die Anwendung molekularbiologischer oder molekularzellbiologischer Ansätze in der Medizin wird heute als Molekularmedizin bezeichnet. Die Molekularbiologie spielt auch eine wichtige Rolle beim Verständnis der Bildung, Wirkung und Regulierung verschiedener Teile von Zellen, die zur wirksamen Bekämpfung neuer Medikamente, zur Diagnose von Krankheiten und zum Verständnis der Zellphysiologie genutzt werden können.

weiterführende Literatur

• Cohen, SN, Chang, NKD, Boyer, H. & Heling, RB Konstruktion biologisch funktioneller Bakterienplasmide in vitro .