Професия молекулярен биолог. Приложна молекулярна биология. А). Основна литература

1. Въведение.

Предмет, задачи и методи на молекулярната биология и генетика. Значението на „класическата” генетика и генетиката на микроорганизмите в развитието на молекулярната биология и генното инженерство. Концепцията за ген в "класическата" и молекулярната генетика, нейната еволюция. Принос на методологията на генното инженерство в развитието на молекулярната генетика. Приложно значение на генното инженерство за биотехнологиите.

2. Молекулярни основи на наследствеността.

Концепцията за клетката, нейния макромолекулен състав. Естеството на генетичния материал. Историята на доказателствата за генетичната функция на ДНК.

2.1. Различни видове нуклеинови киселини.Биологични функции на нуклеиновите киселини. Химическа структура, пространствена структура и физични свойствануклеинова киселина. Характеристики на структурата на генетичния материал на про- и еукариоти. Допълнителни базови двойки на Watson-Crick. Генетичен код. Историята на дешифрирането на генетичния код. Основни свойства на кода: триплетност, код без запетаи, изроденост. Характеристики на кодовия речник, семейства кодони, семантични и „безсмислени“ кодони. Кръгови молекули на ДНК и концепцията за свръхнавиване на ДНК. ДНК топоизомери и техните видове. Механизми на действие на топоизомеразите. Бактериална ДНК гираза.

2.2. ДНК транскрипция.Прокариотна РНК полимераза, нейната субединица и триизмерни структури. Разнообразие от сигма фактори. Промотор на прокариотен ген, неговите структурни елементи. Етапи на транскрипционния цикъл. Иницииране, образуване на "отворен комплекс", удължаване и терминиране на транскрипцията. Затихване на транскрипция. Регулиране на експресията на триптофан оперон. „Рибопревключватели“. Механизми на терминиране на транскрипция. Отрицателна и положителна регулация на транскрипцията. Лактозен оперон. Регулиране на транскрипцията в развитието на ламбда фаг. Принципи на разпознаване на ДНК от регулаторни протеини (CAP протеин и ламбда фагов репресор). Характеристики на транскрипцията при еукариоти. Процесинг на РНК при еукариоти. Капиране, сплайсинг и полиаденилиране на транскрипти. Механизми за снаждане. Ролята на малките ядрени РНК и протеиновите фактори. Алтернативно снаждане, примери.

2.3. Излъчване, неговите етапи, рибозомна функция. Локализация на рибозомите в клетката. Прокариотни и еукариотни видове рибозоми; 70S и 80S рибозоми. Морфология на рибозомите. Разделяне на субчастици (подединици). Кодон-зависимо аминоацил-tRNA свързване в цикъла на удължаване. Кодон-антикодон взаимодействие. Участие на фактора на удължаване EF1 (EF-Tu) в свързването на аминоацил-тРНК към рибозомата. Фактор на удължаване EF1B (EF-Ts), неговата функция, последователност от реакции с негово участие. Антибиотици, които действат на етапа на кодон-зависимо свързване на аминоацил-тРНК към рибозомата. Аминогликозидни антибиотици (стрептомицин, неомицин, канамицин, гентамицин и др.), техният механизъм на действие. Тетрациклини като инхибитори на свързването на аминоацил-тРНК към рибозомата. Иницииране на излъчване. Основни етапи на процеса на иницииране. Иницииране на транслацията при прокариоти: иницииращи фактори, иницииращи кодони, 3¢ край на малка рибозомна субединица РНК и последователност на Shine-Dalgarno в иРНК. Иницииране на транслацията при еукариоти: фактори на иницииране, иницииращи кодони, 5¢ нетранслиран регион и зависимо от капачката „терминално“ иницииране. „Вътрешно“ независимо от капачката започване в еукариотите. Транспептидация. Инхибитори на транспептидацията: хлорамфеникол, линкомицин, амицетин, стрептограмини, анизомицин. Транслокация. Участие на фактора на удължаване EF2 (EF-G) и GTP. Инхибитори на транслокацията: фузидова киселина, виомицин, техните механизми на действие. Прекратяване на предаването. Стоп кодони. Протеин терминиращи фактори на прокариоти и еукариоти; два класа терминиращи фактори и техните механизми на действие. Регулиране на транслацията при прокариотите.

2.4. репликация на ДНКи неговия генетичен контрол. Полимерази, участващи в репликацията, характеристики на тяхната ензимна активност. Точност на възпроизвеждане на ДНК. Ролята на пространствените взаимодействия между базовите двойки на ДНК по време на репликация. Е. coli полимерази I, II и III. Полимераза III субединици. Разклонение за репликация, „водещи“ и „изоставащи“ нишки по време на репликация. Фрагменти от Оказаки. Комплекс от протеини на репликационната вилка. Регулиране на инициирането на репликация в Е. coli. Прекратяване на репликацията в бактериите. Характеристики на регулацията на репликацията на плазмид. Двупосочна репликация и репликация на въртящ се кръг.

2.5. Рекомбинация, неговите видове и модели. Обща или хомоложна рекомбинация. Двуверижни разкъсвания на ДНК, които инициират рекомбинация. Ролята на рекомбинацията в пост-репликативното възстановяване на двуверижни прекъсвания. Структура на Холидей в рекомбинационния модел. Ензимология на общата рекомбинация в Е. coli. RecBCD комплекс. RecA протеин. Ролята на рекомбинацията за осигуряване на синтеза на ДНК по време на увреждане на ДНК, което прекъсва репликацията. Рекомбинация при еукариоти. Рекомбинационни ензими при еукариоти. Сайт-специфична рекомбинация. Разлики в молекулярните механизми на обща и сайт-специфична рекомбинация. Класификация на рекомбинази. Видове хромозомни пренареждания, извършвани по време на сайт-специфична рекомбинация. Регулаторна роля на сайт-специфична рекомбинация в бактерии. Конструиране на хромозоми на многоклетъчни еукариоти с помощта на фагова сайт-специфична рекомбинационна система.

2.6. възстановяване на ДНК.Класификация на видовете репарации. Директно възстановяване на тиминови димери и метилиран гуанин. Изрязване на основите. Гликозилази. Механизмът на възстановяване на несдвоени нуклеотиди (поправка на несъответствие). Избор на ДНК верига, която да бъде поправена. SOS възстановяване. Свойства на ДНК полимеразите, участващи в възстановяването на SOS при прокариоти и еукариоти. Концепцията за "адаптивни мутации" в бактериите. Поправка на двуверижни скъсвания: хомоложна пострепликативна рекомбинация и свързване на нехомоложни краища на ДНК молекулата. Връзката между процесите на репликация, рекомбинация и възстановяване.

3. Процес на мутация.

Ролята на биохимичните мутанти при формирането на теорията за един ген – един ензим. Класификация на мутациите. Точкови мутации и хромозомни пренареждания, механизмът на тяхното образуване. Спонтанна и индуцирана мутагенеза. Класификация на мутагените. Молекулен механизъм на мутагенезата. Връзката между мутагенеза и възстановяване. Идентифициране и селекция на мутанти. Потискане: интрагенно, междугенно и фенотипно.

4. Екстрахромозомни генетични елементи.

Плазмиди, тяхната структура и класификация. Секс фактор F, неговата структура и жизнен цикъл. Ролята на фактор F в мобилизирането на хромозомния трансфер. Образуване на донори от типа Hfr и F." Механизмът на конюгация. Бактериофаги, тяхната структура и жизнен цикъл. Вирулентни и умерени бактериофаги. Лизогения и трансдукция. Обща и специфична трансдукция. Мигриращи генетични елементи: транспозони и IS последователности, тяхната роля в генетичен обмен ДНК -транспозони в геномите на прокариоти и еукариоти IS последователности на бактерии, тяхната структура IS последователности като компонент на F-фактора на бактериите, който определя способността за прехвърляне на генетичен материал по време на конюгация Транспозони на бактерии и еукариотни организми Директни нерепликативни и репликативни механизми на транспониране Концепция за хоризонтален трансфер на транспозони и тяхната роля в структурните пренареждания (ектопична рекомбинация) и в еволюцията на генома.

5. Изследване на генната структура и функция.

Елементи на генетичния анализ. Тест за цис-транс комплементация. Генетично картографиране с помощта на конюгация, трансдукция и трансформация. Изграждане на генетични карти. Фино генетично картографиране. Физически анализ на генната структура. Хетеродуплексен анализ. Рестрикционен анализ. Методи за секвениране. Полимеразна верижна реакция. Идентифициране на генната функция.

6. Регулиране на генната експресия. Концепции за оперон и регулон. Контрол на ниво иницииране на транскрипция. Промоторни, операторни и регулаторни протеини. Положителен и отрицателен контрол на генната експресия. Контрол на ниво терминация на транскрипция. Оперони, контролирани от катаболит: модели на оперони на лактоза, галактоза, арабиноза и малтоза. Оперони, контролирани от атенюатор: модел на триптофановия оперон. Многовалентна регулация на генната експресия. Глобални регулаторни системи. Регулаторен отговор на стреса. Посттранскрипционен контрол. Предаване на сигнала. Регулация, включваща РНК: малки РНК, сензорни РНК.

7. Основи на генното инженерство. Рестрикционни и модифициращи ензими. Изолиране и клониране на гени. Вектори за молекулярно клониране. Принципи на проектиране на рекомбинантна ДНК и въвеждането им в реципиентни клетки. Приложни аспекти на генното инженерство.

А). Основна литература:

1. Watson J., Tooze J., Рекомбинантна ДНК: Кратък курс. – М.: Мир, 1986.

2. Гени. – М.: Мир. 1987 г.

3. Молекулярна биология: структура и биосинтеза на нуклеинови киселини. / Ед. . – М. Висше училище. 1990 г.

4. – Молекулярна биотехнология. М. 2002.

5. Спиринови рибозоми и биосинтеза на протеини. – М.: висше училище, 1986.

б). Допълнителна литература:

1. Хесин геном. – М.: Наука. 1984 г.

2. Генно инженерство на Рибчин. – Санкт Петербург: Санкт Петербургски държавен технически университет. 1999 г.

3. Патрушев ген. – М.: Наука, 2000.

4. Съвременна микробиология. Прокариоти (в 2 тома). – М.: Мир, 2005.

5. М. Сингер, П. Берг. Гени и геноми. – М.: Мир, 1998.

6. Щелкунов инженеринг. – Новосибирск: Из Сиб. университет, 2004.

7. Биология на Степанов. Структура и функции на протеините. – М.: В. Ш., 1996.

Развитието на биохимията, биофизиката, генетиката, цитохимията, много клонове на микробиологията и вирусологията около началото на 40-те години на 20 век. доведе тясно до изучаването на жизнените явления на молекулярно ниво. Успехите, постигнати от тези науки, едновременно и от различни страни, доведоха до осъзнаването на факта, че на молекулярно ниво функционират основните контролни системи на тялото и че по-нататъшният прогрес на тези науки ще зависи от разкриването на биологичните функции на молекулите, изграждащи телата на организмите, тяхното участие в синтеза и разпадането, взаимните трансформации и възпроизводството на съединенията в клетката, както и произтичащия от това обмен на енергия и информация. Така на пресечната точка на тези биологични дисциплини с химията и физиката възниква съвсем нов клон - молекулярната биология.

За разлика от биохимията, вниманието на съвременната молекулярна биология е насочено предимно към изучаването на структурата и функцията на най-важните класове биополимери - протеини и нуклеинови киселини, първите от които определят самата възможност за метаболитни реакции, а вторите - биосинтеза на специфични протеини. Следователно е ясно, че е невъзможно да се направи ясно разграничение между молекулярната биология и биохимията, съответните раздели на генетиката, микробиологията и вирусологията.

Появата на молекулярната биология е тясно свързана с разработването на нови изследователски методи, които вече бяха обсъдени в съответните глави. Наред с развитието на електронната микроскопия и други методи на микроскопската технология, разработените през 50-те години методи за фракциониране на клетъчни елементи играят важна роля. Те се основават на подобрени методи за диференциално центрофугиране (A. Claude, 1954). По това време вече съществуват доста надеждни методи за изолиране и фракциониране на биополимери. Това включва по-специално това, предложено от A. Tiselius (1937; Нобелова награда, 1948) метод за фракциониране на протеини с помощта на електрофореза, методи за изолиране и пречистване на нуклеинови киселини (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky и др.). В същото време в много лаборатории по света са разработени различни методи за хроматографски анализ (A. Martin и R. Singh, 1941; Нобелова награда, 1952), впоследствие значително подобрени.

Рентгеновият дифракционен анализ изигра безценна услуга при дешифрирането на структурата на биополимерите. Основните принципи на рентгеновия дифракционен анализ са разработени в King's College, Лондонския университет, под ръководството на W. Bragg, от група изследователи, включваща J. Bernal, A. Lonsdale, W. Astbury, J. Robertson и други.

Особено внимание заслужава изследването на проф. Московски държавен университет A. R. Kizel за биохимията на протоплазмата (1925 - 1929), които са от голямо значение за последващото развитие на молекулярната биология. Кизел нанесе удар на твърдо вкоренената идея, че в основата на всяка протоплазма лежи специално протеиново тяло - плочите, които уж определят всички негови най-важни структурни и функционални характеристики. Той показа, че пластинът е протеин, който се намира само в миксомицетите, и то на определен етап от развитието, и че в протоплазмата не съществува постоянен компонент - единичен скелетен протеин. Така изследването на проблема за структурата на протоплазмата и функционалната роля на протеините пое по правилния път и получи поле за развитие. Изследванията на Кизел спечелиха световно признание, стимулирайки изучаването на химията компонентиклетки.

Терминът "молекулярна биология", използван за първи път от английския кристалограф, професор от университета в Лийдс У. Астбъри, вероятно се е появил в началото на 40-те години (преди 1945 г.). Изследванията на Астбъри с рентгенова дифракция на протеини и ДНК през 30-те години на миналия век осигуряват основата за неговото последващо успешно дешифриране на вторичната структура на тези биополимери. През 1963 г. Дж. Бернал пише: „Паметник ще му бъде издигнат от цялата молекулярна биология - науката, която той назова и всъщност основа“ * В литературата този термин се появява за първи път може би през 1946 г. статия на W. Astbury „Прогрес на рентгеновия дифракционен анализ на органични и фибриларни съединения“, публикувана в английското списание Nature **. В своята лекция на Харви Астбъри (1950) отбелязва: "Доволен съм, че терминът молекулярна биология сега се използва доста широко, въпреки че е малко вероятно аз да съм бил първият, който го е предложил. Хареса ми и отдавна се опитвам да го разпространя. ” *** . Още през 1950 г. Астбъри е ясно, че молекулярната биология се занимава основно със структурата и конформацията на макромолекулите, чието изследване е от решаващо значение за разбирането на функционирането на живите организми.

* (биогр. Мем. Колеги Рой. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (У. Т. Астбъри. Напредък на рентгеновия анализ на органични и влакнести структури.- Природа,. 1946 г., с. 157, 121.)

*** (У. Т. Астбъри. Приключения в молекулярната биология. Томас Спрингфийлд, 1952 г., стр. 3.)

Молекулярната биология е изправена и се сблъсква всъщност със същите задачи като цялата биология като цяло - познаване на същността на живота и неговите основни явления, по-специално като наследственост и изменчивост. Съвременната молекулярна биология е предназначена предимно за дешифриране на структурата и функцията на гените, пътищата и механизмите за внедряване на генетичната информация на организмите на различни етапи от онтогенезата и на различни етапи от нейното четене. Той е предназначен да разкрие фините механизми на регулиране на генната активност и клетъчната диференциация, да изясни природата на мутагенезата и молекулярната основа на еволюционния процес.

Установяване на генетичната роля на нуклеиновите киселини

Следните открития са от голямо значение за развитието на молекулярната биология. През 1944 г. американските изследователи О. Ейвъри, К. Маклеод (Нобелова награда, 1923 г.) и М. Маккарти показват, че ДНК молекулите, изолирани от пневмококи, имат трансформираща активност. След хидролиза на тези ДНК с дезоксирибонуклеаза, тяхната трансформираща активност напълно изчезва. Така за първи път беше убедително доказано, че ДНК, а не протеинът, е надарен с генетични функции в клетката.

За да бъдем честни, трябва да се отбележи, че феноменът на бактериалната трансформация е открит много по-рано от откритието на Ейвъри, Маклауд и Маккарти. През 1928 г. Ф. Грифит публикува статия, в която съобщава, че след добавяне на убити клетки от капсулиран вирулентен щам към невирулентни (некапсулирани) пневмококи, получената смес от клетки става разрушителна за мишките. Освен това живите пневмококови клетки, изолирани от животни, заразени с тази смес, вече са били вирулентни и са имали полизахаридна капсула. По този начин в този експеримент беше показано, че под въздействието на някои компоненти на убити пневмококови клетки, некапсулираната форма на бактериите се превръща в капсулообразуваща вирулентна форма. 16 години по-късно Ейвъри, Маклауд и Маккарти заменят убитите цели пневмококови клетки с тяхната дезоксирибонуклеинова киселина в този експеримент и показват, че именно ДНК има трансформираща активност (виж също глави 7 и 25). Значението на това откритие е трудно да се надцени. То стимулира изследването на нуклеиновите киселини в много лаборатории по света и принуждава учените да насочат вниманието си към ДНК.

Заедно с откритието на Ейвъри, Маклауд и Маккарти, до началото на 50-те години вече са натрупани доста голямо количество преки и косвени доказателства, че нуклеиновите киселини играят изключителна роля в живота и имат генетична функция. Това, по-специално, беше показано от естеството на локализацията на ДНК в клетката и данните на R. Vendrely (1948), че съдържанието на ДНК на клетка е строго постоянно и корелира със степента на плоидност: в хаплоидните зародишни клетки има е наполовина по-малко ДНК, отколкото в диплоидните соматични клетки. Генетичната роля на ДНК се подкрепя и от нейната изразена метаболитна стабилност. До началото на 50-те години се натрупаха много различни факти, които показват, че повечето от известните мутагенни фактори действат предимно върху нуклеиновите киселини и по-специално върху ДНК (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 и др.).

От особено значение за установяване на генетичната роля на нуклеиновите киселини беше изследването на различни фаги и вируси. През 1933 г. Д. Шлезингер открива ДНК в бактериофага Escherichia coli. След изолирането на вируса на тютюневата мозайка (TMV) в кристално състояние от W. Stanley (1935 г., Нобелова награда, 1946 г.) започва нов етап в изследването на растителните вируси. През 1937 - 1938г F. Bowden и N. Pirie, служители на Rothamsted Agricultural Station (Англия), показаха, че много изолирани от тях растителни вируси не са глобулини, а рибонуклеопротеини и съдържат нуклеинова киселина като задължителен компонент. В самото начало на 40-те години бяха публикувани трудовете на G. Schramm (1940), P. A. Agatov (1941), G. Miller и W. Stanley (1941), които показват, че забележимата химическа модификация на протеиновия компонент не води до загуба на TMV инфекциозност. Това показва, че протеиновият компонент не може да бъде носител на наследствените свойства на вируса, както продължават да вярват много микробиолози. Убедителни доказателства в полза на генетичната роля на нуклеиновата киселина (РНК) в растителните вируси са получени през 1956 г. от G. Schramm в Тюбинген (Германия) и H. Frenkel-Konrath в Калифорния (САЩ). Тези изследователи, почти едновременно и независимо един от друг, изолираха РНК от TMV и показаха, че именно тя, а не протеинът, е инфекциозен: в резултат на заразяване на тютюневите растения с тази РНК се образуват и размножават нормални вирусни частици в тях. Това означава, че РНК съдържа информация за синтеза и сглобяването на всички вирусни компоненти, включително вирусния протеин. През 1968 г. И. Г. Атабеков установява, че протеинът играе важна роля в самата инфекция на растенията - природата на протеина определя обхвата на растенията гостоприемници.

През 1957 г. Frenkel-Konrath е първият, който реконструира TMV от съставните му компоненти - РНК и протеин. Наред с нормалните частици той получава смесени „хибриди“, в които РНК е от един щам, а протеинът от друг. Наследствеността на такива хибриди беше напълно определена от РНК и потомството на вирусите принадлежеше на щама, чиято РНК беше използвана за получаване на оригиналните смесени частици. По-късните експерименти на A. Gierer, G. Schuster и G. Schramm (1958) и G. Vitman (1960 - 1966) показват, че химическата модификация на нуклеиновия компонент на TMV води до появата на различни мутанти на този вирус.

През 1970 г. Д. Балтимор и Г. Темин установяват, че трансферът на генетична информация може да се осъществи не само от ДНК към РНК, но и обратно. Те откриха в някои онкогенни РНК вируси (онкорнавируси) специален ензим, така наречената обратна транскриптаза, който е способен да синтезира допълнително ДНК върху РНК вериги. Това голямо откритие направи възможно да се разбере механизмът на вмъкване на генетична информация на РНК-съдържащи вируси в генома на гостоприемника и да се погледне по нов начин природата на тяхното онкогенно действие.

Откриване на нуклеинови киселини и изследване на техните свойства

Терминът нуклеинови киселини е въведен от немския биохимик R. Altmann през 1889 г., след като тези съединения са открити през 1869 г. от швейцарския лекар F. Miescher. Miescher извлича гнойни клетки с разредена солна киселина в продължение на няколко седмици и оставя почти чист ядрен материал. Той смята този материал за характерно „вещество на клетъчните ядра и го нарича нуклеин. По свойствата си нуклеинът се различава рязко от протеините: той е по-киселинен, не съдържа сяра, но има много фосфор, добре се разтваря в основи, но не се разтварят в разредени киселини.

Miescher изпраща резултатите от своите наблюдения на нуклеина на F. Hoppe-Seyler за публикуване в списанието. Описаното от него вещество беше толкова необичайно (по това време сред всички биологични фосфорсъдържащи съединения беше известен само лецитинът), че Хопе-Сейлер не повярва на експериментите на Мишер, върна му ръкописа и инструктира служителите си Н. Плош и Н. Любавин да провери изводите си върху друг материал . Работата на Miescher „За химическия състав на гнойните клетки“ е публикувана две години по-късно (1871). В същото време бяха публикувани трудове на Hoppe-Seyler и неговите колеги за състава на гнойни клетки, еритроцити на птици, змии и други клетки. През следващите три години нуклеинът е изолиран от животински клетки и дрожди.

В своята работа Miescher отбелязва, че подробното изследване на различни нуклеини може да доведе до установяване на разлики между тях, като по този начин предвижда идеята за специфичност на нуклеинова киселина. Изучавайки млякото от сьомга, Miescher открива, че нуклеинът присъства в него под формата на сол и е свързан с основния протеин, който той нарича протамин.

През 1879 г. А. Косел започва да изучава нуклеини в лабораторията на Hoppe-Seyler. През 1881 г. той изолира хипоксантин от нуклеин, но по това време все още се съмняваше в произхода на тази основа и вярваше, че хипоксантинът може да бъде продукт на разграждане на протеини. През 1891 г. сред продуктите на нуклеинова хидролиза Косел открива аденин, гуанин, фосфорна киселина и друго вещество със свойствата на захар. За изследванията си върху химията на нуклеиновите киселини Косел получава Нобелова награда през 1910 г.

По-нататъшният напредък в дешифрирането на структурата на нуклеиновите киселини е свързан с изследванията на P. Levin и сътрудници (1911 - 1934). През 1911 г. P. Levin и V. Jacobs идентифицират въглехидратния компонент на аденозин и гуанозин; те откриха, че тези нуклеозиди съдържат D-рибоза. През 1930 г. Левин показа, че въглехидратният компонент на дезоксирибонуклеозидите е 2-дезокси-D-рибоза. От работата му стана известно, че нуклеиновите киселини са изградени от нуклеотиди, т.е. фосфорилирани нуклеозиди. Люин вярва, че основният тип връзка в нуклеиновите киселини (РНК) е 2", 5" фосфодиестерна връзка. Тази идея се оказа грешна. Благодарение на работата на английския химик А. Тод (Нобелова награда, 1957 г.) и неговите колеги, както и английските биохимици Р. Маркъм и Дж. Смит, в началото на 50-те години стана известно, че основният тип връзка в РНК е 3", 5"- фосфодиестерна връзка.

Левин показа, че различните нуклеинови киселини могат да се различават по естеството на въглехидратния компонент: някои от тях съдържат захарта дезоксирибоза, докато други съдържат рибоза. В допълнение, тези два вида нуклеинови киселини се различават по природата на една от базите: нуклеиновите киселини от типа пентоза съдържат урацил, а нуклеиновите киселини от типа дезоксипентоза съдържат тимин. Дезоксипентозната нуклеинова киселина (в съвременната терминология дезоксирибонуклеинова киселина - ДНК) обикновено се изолира лесно в големи количества от тимусната жлеза на телетата. Поради това получава името тимонуклеинова киселина. Източникът на пентоза нуклеинова киселина (РНК) е главно дрожди и пшеничен зародиш. Този тип често се нарича нуклеинова киселина на дрожди.

В началото на 30-те години идеята, че растителните клетки се характеризират с нуклеинова киселина от типа на дрождите, а тимонуклеиновата киселина е характерна само за ядрата на животинските клетки, беше доста здраво вкоренена. Двата вида нуклеинови киселини - РНК и ДНК - по това време се наричаха съответно растителни и животински нуклеинови киселини. Въпреки това, както показват ранните изследвания на А. Н. Белозерски, такова разделяне на нуклеинови киселини е неоправдано. През 1934 г. Белозерски за първи път открива тимонуклеинова киселина в растителни клетки: от грахови кълнове той изолира и идентифицира тимин-пиримидинова база, характерна за ДНК. След това открива тимин в други растения (семена от соя, боб). През 1936 г. А. Н. Белозерски и И. И. Дубровская изолират препаративна ДНК от разсад от конски кестен. В допълнение, серия от работи, извършени през 40-те години в Англия от Д. Дейвидсън и неговите колеги, убедително показаха, че растителната нуклеинова киселина (РНК) се съдържа в много животински клетки.

Широкото използване на цитохимичната реакция за ДНК, разработена от R. Felgen и G. Rosenbeck (1924) и реакцията на J. Brachet (1944) за РНК, позволи доста бързо и недвусмислено да се реши въпросът за преференциалната локализация на тези нуклеинови киселини в клетката. Оказа се, че ДНК е концентрирана в ядрото, докато РНК е концентрирана предимно в цитоплазмата. По-късно беше установено, че РНК се съдържа както в цитоплазмата, така и в ядрото и освен това беше идентифицирана цитоплазмената ДНК.

Що се отнася до въпроса за първичната структура на нуклеиновите киселини, до средата на 40-те години идеята на П. Левин е твърдо установена в науката, според която всички нуклеинови киселини са изградени по един и същи тип и се състоят от идентични така наречени тетрануклеотидни блокове. Всеки от тези блокове, според Левин, съдържа четири различни нуклеотида. Тетрануклеотидната теория за структурата на нуклеиновите киселини до голяма степен лиши тези биополимери от специфичност. Ето защо не е изненадващо, че по това време цялата специфика на живите същества се свързваше само с протеини, природата на чиито мономери е много по-разнообразна (20 аминокиселини).

Първата дупка в теорията за тетрануклеотидната структура на нуклеиновите киселини е направена от аналитичните данни на английския химик Дж. Гуланд (1945 - 1947). Когато определя състава на нуклеиновите киселини въз основа на азота на базите, той не получава еквимоларно съотношение на базите, както би трябвало да бъде според теорията на Левин. Тетрануклеотидната теория за структурата на нуклеиновите киселини окончателно се срина в резултат на изследванията на Е. Чаргаф и неговите колеги (1949 - 1951). За да отдели базите, освободени от ДНК в резултат на нейната киселинна хидролиза, Чаргаф използва хартиена хроматография. Всяка от тези бази беше прецизно определена спектрофотометрично. Чаргаф забелязва значителни отклонения от еквимоларното съотношение на базите в ДНК от различен произход и за първи път категорично заявява, че ДНК има изразена видова специфичност. Това сложи край на хегемонията на концепцията за протеиновата специфичност в живата клетка. Анализирайки ДНК от различен произход, Чаргаф открива и формулира уникални модели на състава на ДНК, които навлизат в науката под името правила на Чаргаф. Съгласно тези правила във всички ДНК, независимо от произхода, количеството аденин е равно на количеството тимин (A = T), количеството гуанин е равно на количеството цитозин (G = C), броят на пурините е равно на броя на пиримидините (G + A = C + T), количеството бази с 6-амино групи е равно на броя на базите с 6-кето групи (A+C=G+T). В същото време, въпреки толкова строги количествени съответствия, ДНК различни видовесе различават в стойността на съотношението A+T:G+C. В някои ДНК количеството на гуанин и цитозин преобладава над количеството на аденин и тимин (Чаргаф нарича тези ДНК GC-тип ДНК); други ДНК съдържат повече аденин и тимин, отколкото гуанин и цитозин (тези ДНК се наричат ​​АТ-тип ДНК). Получените от Чаргаф данни за състава на ДНК изиграха изключителна роля в молекулярната биология. Те формират основата за откритието на структурата на ДНК, направено през 1953 г. от Дж. Уотсън и Ф. Крик.

Още през 1938 г. У. Астбъри и Ф. Бел, използвайки рентгенов дифракционен анализ, показаха, че равнините на базите в ДНК трябва да са перпендикулярни на дългата ос на молекулата и да приличат на купчина плочи, разположени една върху друга . Тъй като технологията на рентгеновия структурен анализ се усъвършенства, до 1952 - 1953 г. е натрупана информация, която дава възможност да се прецени дължината на отделните връзки и ъглите на наклон. Това направи възможно да се представи с най-голяма вероятност природата на ориентацията на пръстените на пентозните остатъци в захарно-фосфатния скелет на молекулата на ДНК. През 1952 г. С. Фарберг предлага два спекулативни модела на ДНК, които представляват едноверижна молекула, нагъната или усукана върху себе си. Също толкова спекулативен модел на структурата на ДНК е предложен през 1953 г. от Л. Полинг (носител на Нобелова награда, 1954 г.) и Р. Кори. В този модел три усукани нишки на ДНК образуват дълга спирала, чието ядро ​​е представено от фосфатни групи, а базите са разположени извън нея. До 1953 г. М. Уилкинс и Р. Франклин получават по-ясни рентгенови модели на ДНК. Техният анализ показа пълния провал на моделите на Фарберг, Полинг и Кори. Използвайки данните на Chargaff, сравнявайки различни комбинации от молекулярни модели на отделни мономери и данни от рентгенова дифракция, J. Watson и F. Crick през 1953 г. стигат до извода, че молекулата на ДНК трябва да бъде двуверижна спирала. Правилата на Чаргаф рязко ограничават броя на възможните подредени комбинации от бази в предложения ДНК модел; те предложиха на Уотсън и Крик, че молекулата на ДНК трябва да има специфично сдвояване на основите - аденин с тимин и гуанин с цитозин. С други думи, аденинът в една верига на ДНК винаги стриктно съответства на тимина в друга верига, а гуанинът в една верига задължително съответства на цитозина в друга. Така Уотсън и Крик първи формулират изключително важния принцип на комплементарната структура на ДНК, според който една верига на ДНК допълва другата, т.е. последователността на базите на една верига еднозначно определя последователността на базите в другата ( комплементарна) верига. Стана очевидно, че самата структура на ДНК вече съдържа потенциал за нейното точно възпроизвеждане. Този модел на ДНК структура вече е общоприет. За дешифрирането на структурата на ДНК, Крик, Уотсън и Уилкинс са удостоени с Нобелова награда през 1962 г.

Трябва да се отбележи, че идеята за механизъм за точно възпроизвеждане на макромолекули и предаване на наследствена информация се заражда у нас. През 1927 г. Н. К. Колцов предполага, че по време на клетъчното възпроизвеждане възпроизвеждането на молекулите става чрез точното автокаталитично възпроизвеждане на съществуващите майчини молекули. Вярно, по това време Колцов надари това свойство не с ДНК молекули, а с молекули от протеинова природа, чието функционално значение тогава беше неизвестно. Въпреки това самата идея за автокаталитичното възпроизвеждане на макромолекулите и механизма на предаване на наследствени свойства се оказа пророческа: тя се превърна в водеща идея на съвременната молекулярна биология.

Дългосрочните изследвания (1957-1974) на състава на ДНК в повечето различни организми напълно потвърдиха моделите, открити от Чаргаф, и пълното съответствие с молекулярния модел на структурата на ДНК, предложен от Уотсън и Крик. Тези изследвания показват, че ДНК на различни бактерии, гъби, водорасли, актиномицети, висши растения, безгръбначни и гръбначни животни има специфичен състав. Разликите в състава (съдържанието на AT базови двойки) са особено изразени при микроорганизмите, което се оказва важна таксономична характеристика. При висшите растения и животни видовете специфични вариации в състава на ДНК са много по-слабо изразени. Но това не означава, че тяхната ДНК е по-малко специфична. В допълнение към състава на базите, специфичността до голяма степен се определя от тяхната последователност в ДНК веригите.

Наред с обикновените бази, в ДНК и РНК са открити допълнителни азотни бази. Така G. White (1950) открива 5-метилцитозин в ДНК на растения и животни, а D. Dunn и J. Smith (1958) откриват метилиран аденин в някои ДНК. Метилцитозинът отдавна се смята за отличителен белег на генетичния материал на висшите организми. През 1968 г. А. Н. Белозерски, Б. Ф. Ванюшин и Н. А. Кокурина установяват, че той може да бъде открит и в ДНК на бактериите.

През 1964 г. M. Gold и J. Hurwitz откриват нов клас ензими, които извършват естествена модификация на ДНК - нейното метилиране. След това откритие стана ясно, че минорни (съдържащи се в малки количества) бази се появяват върху готовата полинуклеотидна верига на ДНК в резултат на специфично метилиране на цитозин и аденинови остатъци в специални последователности. По-специално, според Б. Ф. Ванюшин, Я. И. Бурянов и А. Н. Белозерски (1969), метилирането на аденин в ДНК на Escherichia coli може да се случи в стоп кодони. Според A. N. Belozersky и сътрудници (1968 - 1970), както и M. Meselson (САЩ) и V. Arber (Швейцария) (1965 - 1969), метилирането придава на ДНК молекулите уникални индивидуални характеристики и в комбинация с действието на специфични нуклеази, е част от сложен механизъм, който контролира синтеза на ДНК в клетката. С други думи, естеството на метилирането на определена ДНК определя дали тя може да се възпроизвежда в дадена клетка.

Почти по същото време започва изолирането и интензивното изследване на ДНК метилазите и рестрикционните ендонуклеази; през 1969-1975г са установени нуклеотидни последователности, разпознати в ДНК от някои от тези ензими (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Когато различни ДНК се хидролизират от рестрикционен ензим, се освобождават доста големи фрагменти с идентични „лепкави“ краища. Това дава възможност не само да се анализира структурата на гените, както е направено при малки вируси (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), но и да се конструират различни геноми. С откриването на тези специфични рестрикционни ензими, генното инженерство стана осезаема реалност. Гени от различен произход, вградени в малка плазмидна ДНК, вече лесно се въвеждат в различни клетки. Така бяха получени нов тип биологично активни плазмиди, които дадоха резистентност към определени антибиотици (S. Cohen, 1973), рибозомни гени на жаба и Drosophila бяха въведени в плазмидите на Escherichia coli (J. Morrow, 1974; H. Boyer, D. Хогнес, Р. Дейвис, 1974 - 1975). По този начин са открити реални пътища за получаване на принципно нови организми чрез въвеждане и интегриране на различни гени в техния генофонд. Това откритие може да се използва в полза на цялото човечество.

През 1952 г. Г. Уайт и С. Коен откриват, че ДНК на Т-четните фаги съдържа необичайна основа - 5-хидроксиметилцитозин. По-късно, от трудовете на E. Volkin и R. Sinsheimer (1954) и Cohen (1956), става известно, че хидроксиметилцитозиновите остатъци могат да бъдат напълно или частично глюкозидирани, в резултат на което фаговата ДНК молекула е защитена от хидролитично действие на нуклеази.

В началото на 50-те години от трудовете на Д. Дън и Дж. Смит (Англия), С. Заменхоф (САЩ) и А. Вакер (Германия) стана известно, че много изкуствени аналози на бази могат да бъдат включени в ДНК, понякога заменяйки до 50% Timina. По правило тези замествания водят до грешки в репликацията, ДНК транскрипцията и транслацията и появата на мутанти. Така J. Marmur (1962) установи, че ДНК на някои фаги съдържа хидроксиметилурацил вместо тимин. През 1963 г. И. Такахаши и Дж. Мармур откриват, че ДНК на един от фагите съдържа урацил вместо тимин. По този начин се срина друг принцип, по който нуклеиновите киселини преди това бяха разделени. От работата на П. Левин се смяташе, че отличителната черта на ДНК е тиминът, а РНК е урацилът. Стана ясно, че този признак не винаги е надежден и основната разлика в химичната природа на двата вида нуклеинови киселини, както изглежда днес, е само природата на въглехидратния компонент.

По време на изследването на фагите бяха разкрити много необичайни характеристики на организацията на нуклеиновите киселини. От 1953 г. се смяташе, че всички ДНК са двуверижни линейни молекули, а РНК е само едноверижна. Тази позиция е значително разклатена през 1961 г., когато R. Sinsheimer открива, че ДНК на фага φ X 174 е представена от едноверижна кръгова молекула. Вярно, по-късно се оказа, че в тази форма тази ДНК съществува само във вегетативната фагова частица, а репликативната форма на ДНК на този фаг също е двуверижна. Освен това се оказа доста неочаквано, че РНК на някои вируси може да бъде двуверижна. Този нов тип макромолекулна организация на РНК е открита през 1962 г. от P. Gomatos, I. Tamm и други изследователи в някои животински вируси и в туморен вирус на растителна рана. Наскоро В. И. Агол и А. А. Богданов (1970) установиха, че в допълнение към линейните РНК молекули има и затворени или циклични молекули. Те идентифицират циклична двойноверижна РНК, по-специално във вируса на енцефаломиелокардит. Благодарение на работата на X. Deveau, L. Tinoko, T. I. Tikhonenko, E. I. Budovsky и други (1960 - 1974) станаха известни основните характеристики на организацията (полагане) на генетичен материал в бактериофагите.

В края на 50-те години американският учен П. Доти установи, че при нагряване настъпва денатурация на ДНК, придружена от разкъсване на водородни връзки между базовите двойки и разминаване на комплементарни вериги. Този процес има характер на фазов преход „спирала-намотка“ и наподобява топенето на кристали. Следователно Доти нарече процеса на термична денатурация на ДНК стапяне на ДНК. При бавно охлаждане настъпва ренатурация на молекулите, т.е. повторно обединяване на допълващите се половини.

Принципът на ренатурация е използван през 1960 г. от J. Marmur и K. Schildkraut за определяне на степента на "хибридизация" на ДНК на различни микроорганизми. Впоследствие Е. Болтън и Б. Маккарти усъвършенстват тази техника, като предлагат метода на така наречените колони с ДНК агар. Този метод се оказа незаменим при изследване на степента на хомология на нуклеотидната последователност на различни ДНК и определяне на генетичната връзка на различни организми. Денатурирането на ДНК, открито от Доти в комбинация с хроматография върху метилиран албумин и центрофугиране в градиент на плътност, описано от J. Mandel и A. Hershey * (1960) (методът е разработен през 1957 г. от M. Meselson, F. Stahl и D. Winograd) е широко използвани за разделяне, изолиране и анализ на отделни комплементарни ДНК вериги.Например, W. Szybalski (САЩ), използвайки тези техники за разделяне на ламбда фагова ДНК, показа през 1967 - 1969 г., че и двете фагови вериги са генетично активни, а не само една , тъй като това е общоприето (S. Spigelman, 1961). Трябва да се отбележи, че за първи път идеята за генетичното значение на двете ДНК вериги на ламбда фага е изразена в СССР от S. E. Bresler (1961).

* (За работата си върху генетиката на бактериите и вирусите А. Хърши, заедно с М. Делбрюк и С. Лурия, са удостоени с Нобелова награда през 1969 г.)

За да се разбере организацията и функционалната активност на генома, определянето на нуклеотидната последователност на ДНК е от първостепенно значение. Търсенето на методи за такова определяне продължава в много лаборатории по света. В САЩ М. Биър и колегите му се опитват да установят последователността на ДНК с помощта на електронна микроскопия от края на 50-те години, но досега безуспешно. В началото на 50-те години, от първите работи на Sinsheimer, Chargaff и други изследователи върху ензимното разграждане на ДНК, стана известно, че различните нуклеотиди в молекулата на ДНК са разпределени, макар и не хаотично, но неравномерно. Според английския химик К. Бартън (1961) пиримидините (повече от 70%) са концентрирани главно под формата на съответни блокове. A.L. Mazin и B.F. Vanyushin (1968 - 1969) установиха, че различните ДНК имат различна степен на блокиране на пиримидин и че в ДНК на животински организми тя се увеличава значително, когато те се движат от по-ниско към по-високо. По този начин еволюцията на организмите се отразява в структурата на техните геноми. Ето защо, за да разберем еволюционния процес като цяло, сравнителното изследване на структурата на нуклеиновите киселини придобива специално значение. Анализът на структурата на биологично важни полимери и на първо място на ДНК е изключително важен за решаването на много специфични проблеми на филогенетиката и таксономията.

Интересно е да се отбележи, че английският физиолог Е. Ланкестър, който изучава хемоглобините на мекотелите и предусеща идеите на молекулярната биология точно преди 100 години, пише: „Химическите различия между различните видове и родове животни и растения са толкова важни за изясняване на историята на техния произход като разлики в тяхната форма. Ако можем ясно да установим разликите в молекулярната организация и функционирането на организмите, бихме могли да разберем произхода и еволюцията на различните организми много по-добре, отколкото въз основа на морфологични наблюдения. Значението на биохимичните изследвания за таксономията беше подчертано и от В. Л. Комаров, който пише, че „в основата на всички, дори чисто морфологични характеристики, въз основа на които класифицираме и установяваме видове, са именно биохимичните различия“ **.

* (Е. Р. Ланкестър. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- "Pfluger's Archiv fur die gesammte Physiol.", 1871, Bd 4, 319.)

** (В. Л. Комаров. Избрани произведения, т. 1. М.-Л., Издателство на Академията на науките на СССР, 1945 г., стр. 331.)

През 20-те години на миналия век А. В. Благовещенски и С. Л. Иванов правят първите стъпки у нас за изясняване на някои въпроси от еволюцията и систематиката на организмите въз основа на сравнителен анализ на техния биохимичен състав (виж Глава 2). Сравнителният анализ на структурата на протеините и нуклеиновите киселини понастоящем се превръща във все по-осезаема помощ за таксономистите (виж Глава 21). Този метод на молекулярната биология позволява не само да се изясни позицията отделни видовев системата, но също така ни кара да хвърлим нов поглед върху самите принципи на класификация на организмите и понякога дори да преразгледаме цялата система като цяло, както се случи например с таксономията на микроорганизмите. Несъмнено в бъдеще анализът на структурата на генома ще заеме централно място в хемосистематиката на организмите.

Дешифрирането на механизмите на репликация и транскрипция на ДНК е от голямо значение за развитието на молекулярната биология (виж глава 24).

Биосинтеза на протеини

Важна промяна в решаването на проблема с биосинтезата на протеини е свързана с напредъка в изследването на нуклеиновите киселини. През 1941 г. T. Kasperson (Швеция) и през 1942 г. J. Brachet (Белгия) обръщат внимание на факта, че тъканите с активен протеинов синтез съдържат повишено количество РНК. Те заключават, че рибонуклеиновите киселини играят решаваща роля в синтеза на протеини. През 1953 г. Е. Гейл и Д. Фокс изглежда са получили пряко доказателство за прякото участие на РНК в биосинтезата на протеини: според техните данни рибонуклеазата значително потиска включването на аминокиселини в лизатите на бактериалните клетки. Подобни данни са получени от V. Allfrey, M. Deli и A. Mirsky (1953) върху чернодробни хомогенати. По-късно Е. Гейл изостави правилната идея, изразена от него за водещата роля на РНК в синтеза на протеини, погрешно вярвайки, че активирането на синтеза на протеини в безклетъчна система е настъпило под въздействието на някакво друго вещество с неизвестна природа. През 1954 г. P. Zamecnik, D. Littlefield, R. B. Hesin-Lurie и други откриват, че най-активното включване на аминокиселини става в богатите на РНК фракции на субклетъчни частици - микрозоми. P. Zamecnik и E. Keller (1953 - 1954) установяват, че включването на аминокиселини се засилва значително в присъствието на супернатантата при условия на регенерация на АТФ. P. Siekewitz (1952) и M. Hogland (1956) изолират протеинова фракция (pH 5 фракция) от супернатанта, която е отговорна за рязкото стимулиране на включването на аминокиселини в микрозомите. Заедно с протеините, в супернатантата беше открит специален клас РНК с ниско молекулно тегло, сега наречени трансферни РНК (тРНК). През 1958 г. Hoagland и Zamecnik, както и P. Berg, R. Sweet и F. Allen и много други изследователи откриват, че всяка аминокиселина изисква свой собствен специален ензим, ATP, и специфична tRNA, за да бъде активирана. Стана ясно, че tRNA изпълняват изключително функцията на адаптери, т.е. устройства, които намират мястото на съответната аминокиселина в образуващата се протеинова молекула на нуклеиновата матрица (mRNA). Тези изследвания напълно потвърждават адапторната хипотеза на Ф. Крик (1957), която предвижда наличието в клетката на полинуклеотидни адаптери, необходими за правилното подреждане на аминокиселинните остатъци на синтезирания протеин върху нуклеиновата матрица. Много по-късно френският учен Ф. Чапвил (1962 г.) в лабораторията на Ф. Липман (Нобелова награда, 1953 г.) в САЩ много гениално и недвусмислено показва, че местоположението на аминокиселината в синтезираната протеинова молекула се определя изцяло от специфична тРНК, към която е прикрепен. Адаптерната хипотеза на Крик е развита в трудовете на Хоугланд и Замечник.

До 1958 г. станаха известни следните основни етапи на протеиновия синтез: 1) активиране на аминокиселина от специфичен ензим от "рН 5 фракция" в присъствието на АТФ с образуването на аминоацил аденилат; 2) прикрепване на активирана аминокиселина към специфична tRNA с освобождаване на аденозин монофосфат (AMP); 3) свързване на аминоацил-тРНК (тРНК, заредена с аминокиселина) към микрозомите и включване на аминокиселини в протеин с освобождаване на тРНК. Hoagland (1958) отбелязва, че последната стъпка в протеиновия синтез изисква гуанозин трифосфат (GTP).

Трансфер РНК и генен синтез

След откриването на тРНК започват активни търсения за тяхното фракциониране и определяне на нуклеотидната последователност. Най-голям успех постига американският биохимик Р. Холи. През 1965 г. той определя структурата на аланиновата тРНК от дрожди. Използвайки рибонуклеази (гуанил РНКаза и панкреатична РНКаза), Холи разделя молекулата на нуклеиновата киселина на няколко фрагмента, определя нуклеотидната последователност във всеки от тях поотделно и след това реконструира последователността на цялата аланинова тРНК молекула. Този начин за анализ на нуклеотидната последователност се нарича блоков метод. Заслугата на Холи се състои главно в това, че той се е научил да разделя молекулата на РНК не само на малки парчета, както са правили мнозина преди него, но и на големи фрагменти (четвъртини и половини). Това му дава възможност да сглоби правилно отделни малки парчета заедно и по този начин да пресъздаде пълната нуклеотидна последователност на цялата молекула tRNA (Нобелова награда, 1968 г.).

Тази техника веднага беше приета от много лаборатории по света. През следващите две години първичната структура на няколко тРНК беше дешифрирана в СССР и в чужбина. А. А. Баев (1967) и сътрудници първи установяват нуклеотидната последователност в тРНК на валин от дрожди. Към днешна дата са изследвани повече от дузина различни отделни тРНК. Уникален рекорд в определянето на нуклеотидната последователност е поставен в Кеймбридж от F. Sanger и G. Brownlee. Тези изследователи разработиха изненадващо елегантен метод за разделяне на олигонуклеотиди и определиха последователността на така наречената 5 S (рибозомна) РНК от клетки на Escherichia coli (1968). Тази РНК се състои от 120 нуклеотидни остатъка и, за разлика от tRNA, не съдържа допълнителни второстепенни бази, които значително улесняват анализа на нуклеотидната последователност, служейки като уникални ориентири за отделните фрагменти на молекулата. В момента, благодарение на използването на метода Sanger и Brownlee, работата по изучаване на последователността на дълги рибозомни РНК и някои вирусни РНК в лабораторията на J. Ebel (Франция) и други изследователи успешно напредва.

А. А. Баев и сътрудници (1967) откриват, че валиновата тРНК, разрязана наполовина, възстановява своята макромолекулна структура в разтвор и въпреки дефекта в първичната структура има функционалната активност на оригиналната (нативна) молекула. Този подход - реконструиране на изрязана макромолекула след отстраняване на определени фрагменти - се оказа много обещаващ. Сега се използва широко за изясняване на функционалната роля на отделни участъци от определени тРНК.

IN последните годиниГолям успех е постигнат в получаването на кристални препарати на отделни тРНК. Сега няколко лаборатории в САЩ и Англия вече са успели да кристализират много тРНК. Това направи възможно изследването на структурата на tRNA с помощта на рентгенов дифракционен анализ. През 1970 г. Р. Бок представя първите рентгенови дифракционни модели и триизмерни модели на няколко тРНК, които създава в университета на Уисконсин. Тези модели помагат да се определи локализацията на отделните функционално активни места в тРНК и да се разберат основните принципи на функциониране на тези молекули.

От изключителна важност за разкриването на механизма на синтеза на протеини и решаването на проблема за спецификата на този процес беше дешифрирането на природата на генетичния код (виж глава 24), което без преувеличение може да се счита за водещото постижение на естествознанието. 20 век.

Откриването на Р. Холи за първичната структура на tRNA даде тласък на работата на G. Korana * (САЩ) върху синтеза на олигонуклеотиди и ги насочи към синтеза на специфична биологична структура - ДНК молекула, кодираща аланинова tRNA. Първите стъпки, предприети от Korana преди почти 15 години в химическия синтез на къси олигонуклеотиди, достигнаха кулминацията си през 1970 г. с първия извършен генен синтез. Корана и неговите сътрудници първо химически синтезираха къси фрагменти с дължина 8-12 нуклеотидни остатъка от отделни нуклеотиди. Тези фрагменти с дадена нуклеотидна последователност спонтанно образуват двойноверижни комплементарни части с припокриване от 4 - 5 нуклеотида. След това тези завършени парчета бяха съединени край до край в правилния ред с помощта на ензима ДНК лигаза. По този начин, за разлика от репликацията на ДНК молекули, според А. Корнберг ** (виж Глава 24), Корана успява да пресъздаде естествена двойноверижна ДНК молекула според предварително определена програма в съответствие с tRNA последователността, описана от Холи. По подобен начин сега се работи върху синтеза на други гени (М. Н. Колосов, З. А. Шабарова, Д. Г. Кноре, 1970 - 1975).

* (За изследване на генетичния код Г. Корана и М. Ниренберг са удостоени с Нобелова награда през 1968 г.)

** (За откриването на полимеразата и синтеза на ДНК А. Корнберг и за синтеза на РНК С. Очоа е удостоен с Нобелова награда през 1959 г.)

Микрозоми, рибозоми, транслация

В средата на 50-те години се смяташе, че микрозомите са центърът на протеиновия синтез в клетката. Терминът микрозоми е въведен за първи път през 1949 г. от A. Claude за обозначаване на фракцията от малки гранули. По-късно се оказа, че не цялата фракция микрозоми, състояща се от мембрани и гранули, а само малки рибонуклеопротеинови частици са отговорни за синтеза на протеини. Тези частици са наречени рибозоми от R. Roberts през 1958 г.

Класическите изследвания на бактериалните рибозоми са извършени от А. Тисие и Дж. Уотсън през 1958 - 1959 г. Бактериалните рибозоми се оказаха малко по-малки от растителните и животинските. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) и E. N. Svetailo (1966) показват, че рибозомите на хлоропластите на висшите растения и митохондриите принадлежат към бактериалния тип. A. Tissier и други (1958) откриват, че рибозомите се разделят на две неравни субединици, съдържащи по една молекула РНК. В края на 50-те години се смяташе, че всяка рибозомна РНК молекула се състои от няколко къси фрагмента. Въпреки това, AS Spirin беше първият, който показа през 1960 г., че РНК в субчастиците е представена от непрекъсната молекула. D. Waller (1960), след като раздели рибозомните протеини с помощта на електрофореза с нишестен гел, установи, че те са много хетерогенни. Първоначално мнозина се съмняваха в данните на Waller, тъй като изглеждаше, че рибозомният протеин трябва да бъде строго хомогенен, като например протеина TMV. Понастоящем, в резултат на изследванията на Д. Уолър, Р. Траут, П. Трауб и други биохимици, стана известно, че съставът на самите рибозомни частици включва повече от 50 протеина, които са напълно различни по структура. През 1963 г. А. С. Спирин е първият, който разгръща рибозомни субчастици и показва, че рибозомите са компактно усукана рибонуклеопротеидна верига, която може да се разгъне при определени условия. През 1967 - 1968г М. Номура напълно реконструира биологично активната субчастица от рибозомна РНК и протеин и дори получава рибозоми, в които протеинът и РНК принадлежат на различни микроорганизми.

До ден днешен ролята на рибозомната РНК е неясна. Предполага се, че това е уникалната специфична матрица, върху която при образуването на рибозомната частица всеки от многобройните рибозомни протеини намира строго определено място (А. С. Спирин, 1968).

A. Rich (1962) открива агрегати от няколко рибозоми, свързани помежду си чрез иРНК верига. Тези комплекси се наричат ​​полизоми. Откриването на полизомите позволи на Рич и Уотсън (1963) да предположат, че синтезът на полипептидната верига се извършва върху рибозомата, която изглежда се движи по веригата на иРНК. Докато рибозомата се движи по веригата на иРНК в частицата, информацията се чете и се образува полипептидна верига на протеина, а нови рибозоми последователно се прикрепят към освободения четен край на иРНК. От данните на Рич и Уотсън следва, че важността на полизомите в клетката е в масовото производство на протеин чрез последователно четене на матрицата от няколко рибозоми наведнъж.

В резултат на изследванията на М. Ниренберг, С. Очоа, Ф. Липман, Г. Корана и др., през 1963 – 1970г. Стана известно, че наред с иРНК, рибозоми, АТФ и аминоацил-тРНК в процеса на транслация участват голям брой различни фактори, а самият процес на транслация може условно да бъде разделен на три етапа - инициация, сама транслация и терминация.

Инициирането на транслацията означава синтез на първата пептидна връзка в комплекса рибозома - матричен полинуклеотид - аминоацил-тРНК. Не всяка аминоацил-тРНК, а формилметионил-тРНК има такава инициаторна активност. Това вещество е изолирано за първи път през 1964 г. от F. Sanger и K. Marker. S. Bretcher и K. Marker (1966) показаха, че инициаторната функция на формилметионил-tRNA се дължи на нейния повишен афинитет към пептидилния център на рибозомата. Някои протеинови иницииращи фактори, които са изолирани в лабораториите на S. Ochoa, F. Gro и други изследователски центрове, също са изключително важни за началото на транслацията. След образуването на първата пептидна връзка в рибозомата започва същинската транслация, т.е. последователното добавяне на аминоацилов остатък към С-края на полипептида. Много подробности от процеса на превод са изследвани от К. Монро и Дж. Бишоп (Англия), И. Рихлик и Ф. Шорм (Чехословакия), Ф. Липман, М. Бретчър, В. Гилбърт (САЩ) и други изследователи. През 1968 г. А. С. Спирин предлага оригинална хипотеза за обяснение на механизма на рибозомата. Задвижващият механизъм, който осигурява всички пространствени движения на tRNA и mRNA по време на транслация, е периодичното отваряне и затваряне на рибозомните субчастици. Краят на транслацията е кодиран в самата матрица за четене, която съдържа стоп кодони. Както показа S. Brenner (1965 - 1967), такива кодони са триплети UAA, UAG и UGA. M. Capecchi (1967) също идентифицира специални фактори за терминиране на протеини. А. С. Спирин и Л. П. Гаврилова описват така наречения „неензимен“ протеинов синтез в рибозомите (1972 - 1975) без участието на протеинови фактори. Това откритие е важно за разбирането на произхода и еволюцията на протеиновата биосинтеза.

Регулиране на генната и протеиновата активност

След проблема за спецификата на протеиновия синтез, на първо място в молекулярната биология е проблемът за регулирането на протеиновия синтез или, което е същото, регулирането на генната активност.

Функционалното несъответствие на клетките и свързаното с това потискане и активиране на гените отдавна привличат вниманието на генетиците, но доскоро истинският механизъм за контрол на генната активност остава неизвестен.

Първите опити за обяснение на регулаторната активност на гените са свързани с изследването на хистонови протеини. Също така съпрузите Стедман * в началото на 40-те години на XX век. изрази идеята, че хистоните могат да играят основна роля в това явление. Впоследствие те получиха първите ясни данни за разликите в химическа природахистонови протеини. В момента броят на фактите в подкрепа на тази хипотеза се увеличава всяка година.

* (Е. Стедман, Е. Стедман. Основните протеини на клетъчните ядра.- Филос. прев. Рой. Soc. Лондон, 1951 г., v. 235, 565 - 595.)

В същото време се натрупва все по-голямо количество данни, което показва, че регулирането на генната активност е много по-сложен процес от простото взаимодействие на генни региони с хистонови протеинови молекули. През 1960 - 1962г в лабораторията на R. B. Khesin-Lurie беше установено, че гените на фагите започват да се четат неедновременно: гените на фаг Т2 могат да бъдат разделени на ранни гени, чието функциониране е настъпило в първите минути на инфекцията на бактериална клетка и късни гени, които започват да синтезират иРНК след завършване на работата на ранните гени.

През 1961 г. френските биохимици Ф. Якоб и Ж. Монод предлагат схема за регулиране на генната активност, която изиграва изключителна роля за разбирането на регулаторните механизми на клетките като цяло. Според схемата на Джейкъб и Моно в ДНК освен структурни (информационни) гени има и гени регулатори и гени оператори. Регулаторният ген кодира синтеза на специфично вещество - репресор, който може да бъде прикрепен както към индуктора, така и към операторния ген. Операторният ген е свързан със структурни гени, а регулаторният ген е разположен на известно разстояние от тях. Ако в околната среда няма индуктор, например лактоза, тогава репресорът, синтезиран от регулаторния ген, се свързва с операторния ген и, блокирайки го, изключва работата на целия оперон (блок от структурни гени заедно с оператора който ги контролира). При тези условия не се образува ензим. Ако в околната среда се появи индуктор (лактоза), тогава продуктът на регулаторния ген - репресорът - се свързва с лактозата и премахва блока от операторния ген. В този случай става възможна работата на структурния ген, кодиращ синтеза на ензима, и ензимът (лактоза) се появява в околната среда.

Според Джейкъб и Моно тази схема на регулиране се прилага за всички адаптивни ензими и може да възникне както по време на репресия, когато образуването на ензима е потиснато от излишък на реакционния продукт, така и по време на индукция, когато въвеждането на субстрат предизвиква синтеза на ензима. За изследванията си върху регулирането на генната активност Джейкъб и Моно получават Нобелова награда през 1965 г.

Първоначално тази схема изглеждаше твърде пресилена. По-късно обаче стана ясно, че генната регулация на този принцип се извършва не само в бактериите, но и в други организми.

От 1960 г. изследванията на организацията на генома и структурата на хроматина в еукариотните организми заемат видно място в молекулярната биология (J. Bonner, R. Britten, W. Allfrey, P. Walker, Yu. S. Chentsov, I. B. Zbarsky и др.). ) и върху регулирането на транскрипцията (А. Мирски, Г. П. Георгиев, М. Бернстиел, Д. Гол, Р. Цанев, Р. И. Салганик). Естеството на репресора остава неизвестно и противоречиво дълго време. През 1968 г. М. Пташне (САЩ) показа, че репресорът е протеин. Той го изолира в лабораторията на Дж. Уотсън и открива, че репресорът наистина има афинитет към индуктора (лактоза) и в същото време "разпознава" операторния ген на lac оперона и специфично се свързва с него.

През последните 5 - 7 години са получени данни за наличието на друга контролна клетка на генната активност - промоторната. Оказа се, че в близост до мястото на оператора, към което е прикрепен синтезираният върху гена-регулатор продукт - протеиновата субстанция на репресора, има друго място, което също трябва да се класифицира като член на регулаторната система. на генната активност. Към това място е прикрепена протеинова молекула на ензима РНК полимераза. В промоторната област трябва да се осъществи взаимно разпознаване на уникалната нуклеотидна последователност в ДНК и специфичната конфигурация на РНК полимеразния протеин. Процесът на четене на генетична информация с дадена генна последователност на оперона, съседен на промотора, ще зависи от ефективността на разпознаването.

В допълнение към схемата, описана от Jacob и Monod, има и други механизми на генна регулация в клетката. F. Jacob и S. Brenner (1963) установяват, че регулацията на репликацията на бактериалната ДНК се контролира по определен начин от клетъчната мембрана. Експериментите на Джейкъб (1954) за индуцирането на различни профаги убедително показаха, че под въздействието на различни мутагенни фактори в клетката на лизогенните бактерии започва селективна репликация на профагния ген и репликацията на генома на гостоприемника се блокира. През 1970 г. Ф. Бел съобщава, че малки ДНК молекули могат да преминат в цитоплазмата от ядрото и да се транскрибират там.

По този начин регулирането на генната активност може да се извърши на ниво репликация, транскрипция и транслация.

Значителен напредък е постигнат в изучаването на регулацията не само на синтеза на ензими, но и на тяхната активност. Феноменът на регулиране на ензимната активност в клетките беше посочен още през 50-те години от A. Novik и L. Szilard. G. Umbarger (1956) установи, че в клетката има много рационален начин за потискане на ензимната активност чрез крайния продукт на верига от реакции с обратна връзка. Както е установено от J. Monod, J. Changer, F. Jacob, A. Pardee и други изследователи (1956 - 1960), регулирането на ензимната активност може да се извърши според алостеричния принцип. Ензимът или една от неговите субединици, в допълнение към афинитета си към субстрата, има афинитет към един от продуктите на реакционната верига. Под въздействието на такъв сигнален продукт ензимът променя конформацията си толкова много, че губи активност. В резултат на това цялата верига от ензимни реакции се изключва в самото начало. Значителната роля на конформационните промени на протеините в ензимните реакции и в известен смисъл наличието на алостеричен ефект е посочена от D. Wiman и R. Woodward (1952; лауреат на Нобелова награда, 1965).

Структура и функция на протеините

В резултат на работата на Т. Осборн, Г. Хофмайстер, А. Гурбер, Ф. Шулц и много други в края на XIX V. Много животински и растителни протеини са получени в кристална форма. Приблизително по същото време молекулните тегла на определени протеини са определени с помощта на различни физични методи. Така през 1891 г. А. Сабанеев и Н. Александров съобщават, че молекулното тегло на овалбумина е 14 000; през 1905 г. E. Reid установява, че молекулното тегло на хемоглобина е 48 000. Полимерната структура на протеините е открита през 1871 г. от G. Glasivetz и D. Haberman. Идеята за пептидните връзки на отделните аминокиселинни остатъци в протеините е изразена от Т. Курциус (1883). Работа върху химическата кондензация на аминокиселини (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano и D. Traschiatti, 1900) и синтеза на хетерополипептиди (E. Fischer, 1902 - 1907, Нобелова награда, 1902) доведе до разработването на основните принципи на химическата структура на протеините.

Първият кристален ензим (уреаза) е получен през 1926 г. от J. Sumner (Нобелова награда, 1946 г.), а през 1930 г. J. Northrop (Нобелова награда, 1946 г.) получава кристален пепсин. След тази работа стана ясно, че ензимите са протеини по природа. През 1940 г. М. Куниц изолира кристална РНКаза. До 1958 г. вече са известни повече от 100 кристални ензима и над 500 ензима, изолирани в некристална форма. Производството на високо пречистени препарати от отделни протеини допринесе за дешифрирането на тяхната първична структура и макромолекулна организация.

От голямо значение за развитието на молекулярната биология като цяло и човешката генетика в частност е откритието на L. Pauling (1940 г.) на анормален хемоглобин S, изолиран от еритроцитите на хора с тежко наследствено заболяване - сърповидно-клетъчна анемия. През 1955 - 1957г V. Ingram използва метода на "пръстов отпечатък", разработен от F. Sanger (петна, образувани от отделни пептиди по време на хроматография върху хартия), за да анализира продуктите от хидролизата на хемоглобин S с алкали и трипсин. През 1961 г. Ingram съобщава, че хемоглобин S се различава от нормалния хемоглобин само по естеството на един аминокиселинен остатък: в нормален хемоглобинв седма позиция на веригата има остатък от глутаминова киселина, а в хемоглобин S има остатък от валин. Така предположението на Полинг (1949 г.), че сърповидно-клетъчната анемия е заболяване с молекулен характер, беше напълно потвърдено. Наследствена промяна само в един аминокиселинен остатък във всяка половина на макромолекулата на хемоглобина води до факта, че хемоглобинът губи способността си лесно да се разтваря при ниски концентрации на кислород и започва да кристализира, което води до нарушаване на клетъчната структура. Тези изследвания ясно показаха, че протеиновата структура е строго определена аминокиселинна последователност, която е кодирана в генома. Изключителната важност на първичната структура на протеина при образуването на уникална биологично активна конформация на макромолекула се доказва от работата на К. Анфинсен (1951). Anfinsen показа, че биологично активната макроструктура на панкреатичната рибонуклеаза, загубена в резултат на редукция, е предварително определена от аминокиселинната последователност и може да се появи отново спонтанно по време на окисляването на SH групите на цистеинови остатъци с образуването на дисулфидни напречни връзки в строго определени места в пептидната верига на ензима.

Към днешна дата механизмът на действие на голям брой ензими е проучен подробно и е определена структурата на много протеини.

През 1953 г. F. Sanger установява аминокиселинната последователност на инсулина. : Този протеин се състои от две полипептидни вериги, свързани с две дисулфидни напречни връзки. Една от веригите съдържа само 21 аминокиселинни остатъка, а другата - 30 остатъка. Sanger прекарва около 10 години в дешифриране на структурата на този сравнително прост протеин. През 1958 г. той получава Нобелова награда за това изключително изследване. След създаването на автоматичен анализатор на аминокиселини от W. Stein и S. Moore (1957), идентифицирането на продуктите на частична протеинова хидролиза се ускорява значително. Стайн и Мур вече съобщават за това през 1960 г. че са успели да определят последователността на рибонуклеазата, чиято пептидна верига е представена от 124 аминокиселинни остатъка. През същата година в лабораторията на G. Schramm в Тюбинген (Германия) F. Anderer и други определят аминокиселинната последователност в протеина TMV. След това се определя аминокиселинната последователност в миоглобина (A. Edmunson) и α- и β-веригите на човешкия хемоглобин (G. Braunitzer, E. Schroeder и др.), Лизоцим от белтък на пилешко яйце (J. Jollet, D. Кейфийлд). През 1963 г. F. Schorm и B. Keil (Чехословакия) установяват аминокиселинната последователност в молекулата на химотрипсиногена. През същата година е определена аминокиселинната последователност на трипсиногена (F. Schorm, D. Walsh). През 1965 г. К. Такахаши установява първичната структура на Т1 рибонуклеазата. След това аминокиселинните последователности бяха определени за още няколко протеина.

Както е известно, окончателното доказателство за правилността на дефиницията на определена структура е нейният синтез. През 1969 г. R. Merifield (САЩ) е първият, който извършва химичен синтез на панкреатична рибонуклеаза. Използвайки разработения от него метод за синтез на твърда фаза, Мерифийлд добавя една аминокиселина след друга към веригата в съответствие с последователността, описана от Стайн и Мур. В резултат на това той получава протеин, чиито качества са идентични с панкреатичната рибонуклеаза А. За откриването на структурата на рибонуклеазата V. Stein, S. Moore и K. Anfinsen получават Нобелова награда през 1972 г. Този синтез на естествен протеин отваря големи перспективи, което показва възможността за създаване на всякакви протеини според предварително планирана последователност.

От изследванията на рентгеновата дифракция на W. Astbury (1933) следва, че пептидните вериги на протеиновите молекули са усукани или подредени по някакъв строго определен начин. Оттогава много автори са изразили различни хипотези относно методите за сгъване на протеинови вериги, но до 1951 г. всички модели остават спекулативни конструкции, които не съответстват на експерименталните данни. През 1951 г. Л. Полинг и Р. Кори публикуват поредица от блестящи трудове, в които окончателно е формулирана теорията за вторичната структура на протеините - теорията за α-спиралата. Заедно с това стана известно също, че протеините имат и третична структура: α-спиралата на пептидната верига може да бъде сгъната по определен начин, образувайки доста компактна структура.

През 1957 г. Дж. Кендрю и неговите сътрудници за първи път предлагат брак 3D моделмиоглобинови структури. След това този модел беше усъвършенстван в продължение на няколко години, докато окончателната работа, характеризираща пространствената структура на този протеин, се появи през 1961 г. През 1959 г. M. Perutz и сътрудници установяват триизмерната структура на хемоглобина. Изследователите са прекарали повече от 20 години в тази работа (първите рентгенови изображения на хемоглобина са получени от Perutz през 1937 г.). Тъй като молекулата на хемоглобина се състои от четири субединици, дешифрирайки нейната организация, Перуц е първият, който описва кватернерната структура на протеина. За работата си по определяне на триизмерната структура на протеините Кендрю и Перуц са удостоени с Нобелова награда през 1962 г.

ПОЗВОЛЕНО е създаването на пространствен модел на структурата на хемоглобина от Perutz. да се доближи до разбирането на механизма на функциониране на този протеин, за който е известно, че транспортира кислород в животински клетки. През 1937 г. Ф. Гауровиц стига до извода, че взаимодействието на хемоглобина с кислорода и въздуха трябва да бъде придружено от промяна в структурата на протеина. През 60-те години Перуц и колегите му откриват забележимо изместване на хемоглобиновите вериги след окисляването му, причинено от изместване на железни атоми в резултат на свързване с кислород. На тази основа се формират идеи за "дишането" на протеиновите макромолекули.

През 1960 г. Д. Филипс и неговите сътрудници започват изследвания с рентгенова дифракция на молекулата на лизозима. До 1967 г. те повече или по-малко точно установяват подробностите за организацията на този протеин и локализацията на отделните атоми в неговата молекула. В допълнение, Филипс установи естеството на добавянето на лизозим към субстрата (триацетилглюкозамин). Това направи възможно пресъздаването на механизма на действие на този ензим. По този начин познаването на първичната структура и макромолекулната организация позволи не само да се установи природата на активните центрове на много ензими, но и да се разкрие напълно механизмът на функциониране на тези макромолекули.

Използването на методи на електронна микроскопия помогна да се разкрият принципите на макромолекулната организация на такива сложни протеинови образувания като нишки от колаген, фибриноген, контрактилни мускулни фибрили и др. В края на 50-те години бяха предложени модели на мускулния контрактилен апарат. Откриването на АТФазната активност на миозина от В. А. Енгелхард и М. Н. Любимова (1939) е от изключителна важност за разбирането на механизма на мускулната контракция. Това означава, че в основата на акта на мускулна контракция е промяна във физикохимичните свойства и макромолекулната организация на контрактилния протеин под въздействието на аденозинтрифосфорна киселина (виж също глава 11).

За да се разберат принципите на сглобяване на биологични структури, вирусологичните изследвания бяха от съществено значение (вижте Глава 25).

Нерешени проблеми

Основният напредък в съвременната молекулярна биология е постигнат главно в резултат на изследването на нуклеиновите киселини. Но дори и в тази област не всички проблеми все още са решени. По-специално, дешифрирането на цялата нуклеотидна последователност на генома ще изисква големи усилия. Този проблем от своя страна е неразривно свързан с проблема за хетерогенността на ДНК и изисква разработването на нови усъвършенствани методи за фракциониране и изолиране на отделни молекули от общия генетичен материал на клетката.

Досега усилията бяха насочени главно към отделното изследване на протеини и нуклеинови киселини. В клетката тези биополимери са неразривно свързани помежду си и функционират главно под формата на нуклеопротеини. Ето защо сега необходимостта от изучаване на взаимодействието на протеини и нуклеинови киселини стана особено остра. Проблемът за разпознаването на определени участъци от нуклеинови киселини от протеини излиза на преден план. Вече са предприети стъпки за изучаване на това взаимодействие на тези биополимери, без което пълното разбиране на структурата и функциите на хромозомите, рибозомите и други структури е немислимо. Без това също е невъзможно да се разбере регулацията на генната активност и накрая да се дешифрират принципите на действие на механизмите за синтез на протеини. След работата на Jacob и Monod се появиха някои нови данни за регулаторното значение на мембраните в синтеза на ядрен материал. Това поставя задачата за по-задълбочено изследване на ролята на мембраните в регулацията на репликацията на ДНК. Като цяло, проблемът за регулиране на генната активност и клетъчната активност като цяло се превърна в един от най-важните проблеми на съвременната молекулярна биология.

Съвременно състояние на биофизиката

Биофизиката се развива в тясна връзка с проблемите на молекулярната биология. Интересът към тази област на биологията беше стимулиран, от една страна, от необходимостта от цялостно изследване на ефектите на различните видове радиация върху тялото, а от друга страна, от необходимостта от изучаване на физичните и физикохимичните основите на жизнените явления, протичащи на молекулярно ниво.

Получаването на точна информация за молекулярните структури и процесите, протичащи в тях, стана възможно в резултат на използването на нови фини физикохимични методи. Въз основа на постиженията на електрохимията беше възможно да се подобри методът за измерване на биоелектричните потенциали чрез използване на йон-селективни електроди (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60-те години). Инфрачервената спектроскопия (използвайки лазерни устройства) все повече навлиза в практиката, което позволява да се изследват конформационните промени в протеините (I. Plotnikov, 1940). Ценна информация предоставя и методът на електронния парамагнитен резонанс (E.K. Zavoisky, 1944) и биохемолуминесцентният метод (B.N. Tarusov et al., 1960), които позволяват по-специално да се прецени транспортирането на електрони по време на окислителни процеси.

До 50-те години биофизиката вече печели силна позиция. Има нужда от подготовка на квалифицирани специалисти. Ако през 1911 г. в Европа само университетът в Печ, Унгария, е имал катедра по биофизика, то през 1973 г. такива катедри съществуват в почти всички големи университети.

През 1960 г. е организирано Международното общество по биофизика. През август 1961 г. в Стокхолм се провежда първият Международен биофизичен конгрес. Вторият конгрес се провежда през 1965 г. в Париж, третият през 1969 г. в Бостън, четвъртият през 1972 г. в Москва.

В биофизиката се поддържа ясно разграничение между две области с различно съдържание - молекулярна биофизика и клетъчна биофизика. Това разграничение получава и организационен израз: създават се отделни отдели на тези две области на биофизиката. В Московския университет първата катедра по биофизика е създадена през 1953 г. във Факултета по биология и почви, а малко по-късно катедрата по биофизика възниква във Физическия факултет. Катедрите бяха организирани по същия принцип в много други университети.

Молекулярна биофизика

През последните години връзката между молекулярната биофизика и молекулярната биология става все по-силна и сега понякога може да бъде трудно да се определи къде е границата между тях. При обща атака срещу проблема с наследствената информация подобно сътрудничество между биофизиката и молекулярната биология е неизбежно.

Основното направление в изследователска работае изучаването на физиката на нуклеиновите киселини - ДНК и РНК. Използването на горните методи и най-вече на рентгеновия дифракционен анализ допринесе за дешифрирането молекулярна структурануклеинова киселина. В момента се провеждат интензивни изследвания за изследване на поведението на тези киселини в разтвори. Особено внимание е отделено на конформационните преходи спирала-намотка, изследвани чрез промени във вискозитета, оптичните и електрическите параметри. Във връзка с изучаването на механизмите на мутагенезата се развиват изследвания за изследване на ефекта на йонизиращото лъчение върху поведението на нуклеиновите киселини в разтвори, както и ефекта на радиацията върху нуклеиновите киселини на вируси и фаги. Влиянието на ултравиолетовото лъчение, за някои спектрални области от което е известно, че се абсорбират добре от нуклеиновите киселини, беше подложено на цялостен анализ. Голям дял в този тип изследвания заема откриването на активни радикали на нуклеинови киселини и протеини чрез електронен парамагнитен резонанс. Използването на този метод е свързано с появата на цяла независима посока.

Проблемът с кодирането на ДНК и РНК информацията и нейното предаване по време на протеиновия синтез отдавна е от интерес за молекулярната биофизика и физиците многократно са изразявали определени съображения по този въпрос (Е. Шрьодингер, Г. Гамов). Декодирането на генетичния код доведе до множество теоретични и експериментални изследвания върху структурата на спиралата на ДНК, механизма на плъзгане и усукване на нейните нишки и изследването физическа силаучастващи в тези процеси.

Молекулярната биофизика оказва значителна помощ на молекулярната биология при изучаването на структурата на протеиновите молекули с помощта на рентгенов дифракционен анализ, използван за първи път през 1930 г. от J. Bernal. Именно в резултат на използването на физични методи в комбинация с биохимични (ензимни методи) бяха разкрити молекулярната конформация и последователността на аминокиселините в редица протеини.

Съвременните изследвания с електронна микроскопия, които разкриват наличието на сложни мембранни системи в клетките и техните органели, стимулират опитите за разбиране на тяхната молекулна структура (вижте глави 10 и 11). Изследван интравитално химичен съставмембрани и по-специално свойствата на техните липиди. Установено е, че последните са способни на реакции на пероксидация и неензимни верижни окислителни реакции (Ю. А. Владимиров и Ф. Ф. Литвин, 1959; Б. Н. Тарусов и др., 1960; И. И. Иванов, 1967), което води до нарушаване на мембранните функции. За да изследват състава на мембраните, те също започнаха да използват методи математическо моделиране(В. Ц. Пресман, 1964 - 1968; М. М. Шемякин, 1967; Ю. А. Овчинников, 1972).

Клетъчна биофизика

Значително събитие в историята на биофизиката беше формирането през 50-те години на ясни идеи за термодинамиката на биологичните процеси, в резултат на което предположенията за възможността за независимо образуване на енергия в живите клетки, противно на втория закон на термодинамиката, бяха окончателно елиминирани. Разбирането на действието на този закон в биологичните системи е свързано с въвеждането от белгийския учен И. Пригожин (1945) * в биологичната термодинамика на концепцията за отворени системи, които обменят енергия и материя с външната среда. Пригожин показа, че положителната ентропия се образува в живите клетки по време на работните процеси в съответствие с втория закон на термодинамиката. Въведените от него уравнения определят условията, при които възниква т. нар. стационарно състояние (по-рано се наричаше още динамично равновесие), при което количеството свободна енергия (негентропия), постъпваща в клетките с храната, компенсира нейното потребление, а положителната ентропия е отстранени. Това откритие затвърди общата биологична идея за неразривната връзка между външната и вътрешната среда на клетките. Той постави основата за истинско изследване на термодинамиката на живите системи, включително метода на моделиране (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (Общата теория на отворените системи е представена за първи път от Л. Берталанфи през 1932 г.)

Според основния принцип на биотермодинамиката, необходимо условие за съществуването на живота е стационарността в развитието на неговите биохимични процеси, за осъществяването на които е необходимо съгласуване на скоростите на множество метаболитни реакции. Въз основа на новата биофизична термодинамика се появи посока, която идентифицира външни и вътрешни фактори, които осигуряват тази координация на реакциите и я правят стабилна. През последните две десетилетия е разкрита основна роля в поддържането на стационарно състояние на системата от инхибитори и особено антиоксиданти (B.N. Tarusov и A.I. Zhuravlev, 1954, 1958). Установено е, че надеждността на стационарното развитие е свързана с факторите на околната среда (температура) и физични и химични свойстваклетъчна среда.

Съвременните принципи на биотермодинамиката позволиха да се даде физична и химическа интерпретация на механизма на адаптация. Според нашите данни, адаптирането към условията на околната среда може да възникне само ако, когато те се променят, организмът е в състояние да установи стационарност в развитието на биологичните химична реакция(B.N. Тарусов, 1974). Възникна въпросът за разработването на нови методи, които биха позволили оценка на стационарното състояние интравитално и прогнозиране на възможните му нарушения. Въвеждането на кибернетичните принципи на саморегулиращите се системи в биотермодинамиката и изследването на процесите на биологична адаптация обещава голяма полза. Стана ясно, че за решаване на проблема със стабилността на стационарното състояние е важно да се вземат предвид така наречените смущаващи фактори, които включват по-специално неензимни реакции на окисление на липидите. Напоследък все повече се разширяват изследванията на процесите на пероксидация в липидните фази на живите клетки и растежа на активни радикални продукти, които нарушават регулаторните функции на мембраните. Източникът на информация за тези процеси е откриването на активни пероксидни радикали и пероксидни съединения на биолипидите (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 и др.). За откриване на радикали се използва биохемилуминесценция, която възниква в липидите на живите клетки по време на тяхната рекомбинация.

Въз основа на физикохимичните идеи за стабилността на стационарното състояние възникнаха биофизичните идеи за адаптирането на растенията към промените в условията на околната среда като нарушение на инхибиторните антиоксидантни системи (Б. Н. Тарусов, Я. Е. Доскоч, Б. М. Китлаев, А. М. Агавердиев , 1968 - 1972). Това отвори възможността за оценка на свойства като устойчивост на замръзване и устойчивост на сол, както и за правене на подходящи прогнози при отглеждане на селскостопански растения.

През 50-те години е открито ултраслабо сияние - биохемолуминесценция на редица биологични обекти във видимата и инфрачервената част на спектъра (Б. Н. Тарусов, А. И. Журавлев, А. И. Поливода). Това стана възможно в резултат на разработването на методи за записване на ултраслаби светлинни потоци с помощта на фотоумножители (Л. А. Кубецки, 1934 г.). Като резултат от биохимични реакции, протичащи в жива клетка, биохемилуминесценцията дава възможност да се преценят важни окислителни процеси във веригите за пренос на електрони между ензимите. Откриването и изследването на биохемолуминесценцията е от голямо теоретично и практическо значение. Така Б. Н. Тарусов и Ю. Б. Кудряшов отбелязват голямата роля на продуктите на окисление на ненаситените мастни киселинив механизма на възникване на патологични състояния, развиващи се под влияние йонизиращо лъчение, по време на канцерогенеза и други нарушения на нормалните клетъчни функции.

През 50-те години, във връзка с бързото развитие на ядрената физика, от биофизиката се отделя радиобиологията, която изучава биологичните ефекти на йонизиращото лъчение. Получаване на изкуствени радиоактивни изотопи, създаване на термоядрени оръжия, ядрени реактори и развитие на други форми на практическа употреба атомна енергияповдигна с цялата си спешност проблема за защитата на организмите от вредното въздействие на йонизиращото лъчение, разработвайки теоретични основи за профилактика и лечение на лъчева болест. За да направите това, беше необходимо преди всичко да разберете кои клетъчни компоненти и метаболитни връзки са най-уязвими.

Обектът на изследване на биофизиката и радиобиологията беше да се изясни природата на първичните химични реакции, протичащи в живите субстрати под въздействието на радиационна енергия. Тук беше важно не само да разберем механизмите на това явление, но и да можем да повлияем на процеса на обмен на физическа енергия за химическа енергия и да намалим коефициента му на „полезно“ действие. Работата в тази насока е инициирана от изследванията на школата на Н. Н. Семенов (1933) в СССР и Д. Хиншелуд (1935) в Англия.

Голямо място в радиобиологичните изследвания е заето от изучаването на степента на радиационна устойчивост на различни организми. Установено е, че повишената радиорезистентност (например пустинни гризачи) се дължи на високата антиоксидантна активност на липидите на клетъчната мембрана (M. Chang et al., 1964; N.K. Ogryzov et al., 1969). Оказа се, че токоферолите, витамин К и тио съединенията играят важна роля във формирането на антиоксидантните свойства на тези системи (I. I. Ivanov et al., 1972). През последните години изследванията върху механизмите на мутагенезата също привлякоха голямо внимание. За тази цел се изследва влиянието на йонизиращото лъчение върху поведението на нуклеиновите киселини и протеините in vitro, както и във вирусите и фагите (A. Gustafson, 1945 - 1950).

Борбата за по-нататъшно повишаване на ефективността на химическата защита, търсенето на по-ефективни инхибитори и принципи на инхибиране остават основните задачи на биофизиката в тази посока.

Напредва изучаването на възбудените състояния на биополимерите, които обуславят тяхната висока химична активност. Най-успешните изследвания са проведени върху възбудени състояния, които възникват в първичния етап на фотобиологичните процеси - фотосинтеза и зрение.

По този начин е направен солиден принос за разбирането на първичното активиране на молекулите на растителните пигментни системи. Установено е голямото значение на преноса (миграцията) на енергия от възбудени състояния без загуба от активирани пигменти към други субстрати. Голяма роля в развитието на тези идеи изиграха теоретичните трудове на А. Н. Теренин (1947 г. и по-късно). A. A. Krasnovsky (1949) открива и изследва реакцията на обратима фотохимична редукция на хлорофила и неговите аналози. Сега има общо убеждение, че в близко бъдеще ще бъде възможно да се възпроизведе фотосинтезата при изкуствени условия (виж също Глава 5).

Биофизиците продължават да работят, за да разкрият естеството на мускулната контракция и механизмите на нервно възбуждане и проводимост (виж Глава 11). Актуално значение придобиха и изследванията на механизмите на преход от възбудено състояние към нормално състояние. Сега възбуденото състояние се разглежда като резултат от автокаталитична реакция, а инхибирането като следствие от рязка мобилизация на инхибиторната антиоксидантна активност в резултат на молекулярни пренареждания в съединения като токоферол (I.I. Ivanov, O.R. Kols, 1966; O.R. Kols, 1970).

Най-важният общ проблем на биофизиката остава познаването на качествените физични и химични характеристики на живата материя. Свойства като способността на живите биополимери селективно да свързват калия или да поляризират електрическия ток не могат да бъдат запазени дори при най-внимателно отстраняване от тялото. Ето защо клетъчната биофизика продължава интензивно да разработва критерии и методи за прижизнено изследване на живата материя.

Въпреки младостта на молекулярната биология, успехите, постигнати в тази област, са наистина зашеметяващи. За сравнително краткосрочене установена природата на гена и основните принципи на неговата организация, възпроизвеждане и функциониране. Освен това е извършено не само размножаване на гени in vitro, но и за първи път е завършен пълен синтез на самия ген. Напълно е дешифриран генетичният код и е решен най-важният биологичен проблем за спецификата на биосинтезата на протеини. Идентифицирани и проучени са основните пътища и механизми на образуване на протеини в клетката. Първичната структура на много транспортни РНК - специфични адапторни молекули, които превеждат езика на нуклеиновите матрици на езика на аминокиселинната последователност на синтезирания протеин - е напълно определена. Аминокиселинната последователност на много протеини е напълно дешифрирана и е установена пространствената структура на някои от тях. Това позволи да се изяснят принципът и детайлите на функционирането на ензимните молекули. Извършен е химичен синтез на един от ензимите рибонуклеаза. Установени са основните принципи на организация на различни субклетъчни частици, много вируси и фаги и са разкрити основните пътища на тяхната биогенеза в клетката. Разкрити са подходи за разбиране на начините за регулиране на генната активност и изясняване на регулаторните механизми на живота. Вече прост списък на тези открития показва, че втората половина на 20 век. бе белязан от огромен напредък в биологията, който се дължи преди всичко на задълбочено изследване на структурата и функциите на биологично важни макромолекули - нуклеинови киселини и протеини.

Постиженията на молекулярната биология вече се използват в практиката и дават осезаеми резултати в медицината, селското стопанство и някои индустрии. Няма съмнение, че въздействието на тази наука ще нараства всеки ден. Основният резултат обаче все пак трябва да се счита, че под влиянието на успехите на молекулярната биология се засили увереността в съществуването на неограничени възможности по пътя към разкриването на най-съкровените тайни на живота.

В бъдеще, очевидно, ще бъдат открити нови пътища за изследване на биологичната форма на движение на материята - от молекулярно ниво биологията ще премине към атомно ниво. Сега обаче може би няма нито един изследовател, който да може реалистично да предвиди развитието на молекулярната биология дори за следващите 20 години.

Комикс за конкурса „био/мол/текст”: Днес молекулярен биологЕпруветката ще ви преведе през света на удивителната наука - молекулярната биология! Ще започнем с исторически екскурз през етапите на неговото развитие, описвайки основните открития и експерименти от 1933 г. Също така ясно ще ви разкажем за основните методи на молекулярната биология, които направиха възможно манипулирането, промяната и изолирането на гени. Появата на тези методи послужи като силен тласък за развитието на молекулярната биология. Нека си припомним и ролята на биотехнологиите и да се докоснем до една от най-популярните теми в тази област – редактирането на генома с помощта на системи CRISPR/Cas.

Генерален спонсор на състезанието и партньор на номинацията Сколтех е .

Спонсор на състезанието е компанията Diaem: най-големият доставчик на оборудване, реактиви и консумативи за биологични изследвания и производство.

Наградата на публиката бе спонсорирана от компанията.

Спонсор "Книга" на конкурса - "Алпина нехудожествена литература"

1. Въведение. Същността на молекулярната биология

Изучава основите на живота на организмите на ниво макромолекули. Целта на молекулярната биология е да установи ролята и механизмите на функциониране на тези макромолекули въз основа на познаването на техните структури и свойства.

Исторически погледнато, молекулярната биология се формира по време на развитието на области на биохимията, които изучават нуклеинови киселини и протеини. Докато биохимията изучава метаболизма, химичния състав на живите клетки, организми и химичните процеси, протичащи в тях, молекулярната биология се фокусира върху изучаването на механизмите на предаване, възпроизвеждане и съхранение на генетична информация.

А обектът на изследване на молекулярната биология са самите нуклеинови киселини - дезоксирибонуклеинови киселини (ДНК), рибонуклеинови киселини (РНК) - и протеини, както и техните макромолекулни комплекси - хромозоми, рибозоми, мултиензимни системи, които осигуряват биосинтезата на протеини и нуклеинови киселини. Молекулярната биология също граничи с обектите на изследване и частично съвпада с молекулярната генетика, вирусологията, биохимията и редица други сродни биологични науки.

2. Исторически екскурзии в етапите на развитие на молекулярната биология

Като отделен дял от биохимията молекулярната биология започва да се развива през 30-те години на миналия век. Още тогава възниква необходимостта от разбиране на феномена на живота на молекулярно ниво, за да се изследват процесите на предаване и съхранение на генетична информация. По това време задачата на молекулярната биология беше установена в изучаването на свойствата, структурата и взаимодействието на протеините и нуклеиновите киселини.

Терминът "молекулярна биология" е използван за първи път през 1933 година Уилям Астбъри по време на изследване на фибриларни протеини (колаген, кръвен фибрин, мускулни контрактилни протеини). Астбъри изучава връзката между молекулярната структура и биологичните, физически характеристики на тези протеини. В ранните дни на молекулярната биология РНК се смяташе за компонент само на растенията и гъбите, а ДНК - само на животните. И в 1935 Откриването на ДНК на грах от Андрей Белозерски доведе до установяването на факта, че ДНК се съдържа във всяка жива клетка.

IN 1940 През 2009 г. колосално постижение беше установяването от Джордж Бийдъл и Едуард Татъм на причинно-следствената връзка между гените и протеините. Хипотезата на учените „Един ген – един ензим“ е в основата на концепцията, че специфичната структура на протеина се регулира от гени. Вярва се, че генетична информациякодиран от специална последователност от нуклеотиди в ДНК, която регулира първичната структура на протеините. По-късно беше доказано, че много протеини имат кватернерна структура. В образуването на такива структури участват различни пептидни вериги. Въз основа на това разпоредбата за връзката между гена и ензима беше донякъде трансформирана и сега звучи като „Един ген - един полипептид“.

IN 1944 През 2006 г. американският биолог Осуалд ​​Ейвъри и колегите му (Колин Маклауд и Маклийн Маккарти) доказаха, че веществото, което причинява трансформацията на бактериите, е ДНК, а не протеини. Експериментът послужи като доказателство за ролята на ДНК в предаването на наследствена информация, изтривайки остарелите знания за протеиновата природа на гените.

В началото на 50-те години Фредерик Сангер показа, че протеиновата верига е уникална последователност от аминокиселинни остатъци. IN 1951 И 1952 години ученият определя пълната последователност на две полипептидни вериги – говежди инсулин IN(30 аминокиселинни остатъка) и А(21 аминокиселинни остатъка), съответно.

Приблизително по същото време, в 1951–1953 gg., Erwin Chargaff формулира правила за съотношението на азотните бази в ДНК. Според правилото, независимо от видовите различия на живите организми в тяхната ДНК, количеството на аденин (A) е равно на количеството на тимин (T), а количеството на гуанин (G) е равно на количеството на цитозин. (° С).

IN 1953 Генетичната роля на ДНК е доказана. Джеймс Уотсън и Франсис Крик, въз основа на рентгеновата дифракционна картина на ДНК, получена от Розалинд Франклин и Морис Уилкинс, установиха пространствената структура на ДНК и изложиха хипотеза, която по-късно беше потвърдена, за механизма на нейната репликация (дупликация) , което е в основата на наследствеността.

1958 година - формирането на централната догма на молекулярната биология от Франсис Крик: трансферът на генетична информация протича в посока ДНК → РНК → протеин.

Същността на догмата е, че в клетките има определен насочен поток от информация от ДНК, която от своя страна е оригиналният генетичен текст, състоящ се от четири букви: A, T, G и C. Записан е в двойната спирала на ДНК под формата на последователности от тези букви - нуклеотиди.

Този текст е транскрибиран. И самият процес се нарича транскрипция. По време на този процес се синтезира РНК, която е идентична с генетичния текст, но с разлика: в РНК вместо Т има U (урацил).

Тази РНК се нарича информационна РНК (тРНК), или матрица (тРНК). ИзлъчванеиРНК се осъществява с помощта на генетичния код под формата на триплетни последователности от нуклеотиди. По време на този процес текстът на ДНК и РНК нуклеиновите киселини се преобразува от четирибуквен текст в двадесетбуквен аминокиселинен текст.

Има само двадесет естествени аминокиселини, а в текста на нуклеиновите киселини има четири букви. Поради това чрез генетичния код се извършва превод от четирибуквена азбука към двадесетбуквена, в която всеки три нуклеотида съответстват на аминокиселина. Така че можете да направите до 64 трибуквени комбинации от четири букви, въпреки факта, че има 20 аминокиселини.От това следва, че генетичният код задължително трябва да има свойството на израждане. По това време обаче генетичният код не е бил известен и дори не е започнал да се дешифрира, но Крик вече е формулирал централната си догма.

Въпреки това имаше увереност, че кодът трябва да съществува. По това време вече е доказано, че този код е триплет. Това означава, че конкретно три букви в нуклеиновите киселини ( кодони) отговарят на всяка аминокиселина. Има само 64 от тези кодони, те кодират 20 аминокиселини. Това означава, че всяка аминокиселина съответства на няколко кодона наведнъж.

По този начин можем да заключим, че централната догма е постулат, който гласи, че в клетката възниква насочен поток от информация: ДНК → РНК → протеин. Крик подчерта основното съдържание на централната догма: обратният поток от информация не може да възникне, протеинът не е в състояние да промени генетичната информация.

Това е основното значение на централната догма: протеинът не е в състояние да промени и преобразува информацията в ДНК (или РНК), потокът винаги върви само в една посока.

Известно време след това е открит нов ензим, който не е бил известен по времето, когато е формулирана централната догма - обратна транскриптаза, който синтезира ДНК от РНК. Ензимът е открит във вируси, които имат генетична информация, кодирана в РНК, а не в ДНК. Такива вируси се наричат ​​ретровируси. Те имат вирусна капсула, съдържаща РНК и специален ензим. Ензимът е обратна транскриптаза, която синтезира ДНК, използвайки шаблона на тази вирусна РНК, и тази ДНК след това служи като генетичен материал за по-нататъшното развитие на вируса в клетката.

Разбира се, това откритие предизвика голям шок и много спорове сред молекулярните биолози, тъй като се смяташе, че въз основа на централната догма това не би могло да бъде възможно. Крик обаче веднага обясни, че никога не е казвал, че е невъзможно. Той каза само, че никога не може да възникне поток от информация от протеини към нуклеинови киселини, но в рамките на нуклеиновите киселини е напълно възможен всякакъв вид процес: синтез на ДНК върху ДНК, ДНК върху РНК, РНК върху ДНК и РНК върху РНК.

След като централната догма беше формулирана, редица въпроси все още остават: Как четиринуклеотидната азбука, която изгражда ДНК (или РНК), кодира 20-буквената азбука на аминокиселините, които изграждат протеините? Каква е същността на генетичния код?

Първите идеи за съществуването на генетичен код са формулирани от Александър Даунс ( 1952 ж.) и Георги Гъмов ( 1954 Ж.). Учените са показали, че нуклеотидната последователност трябва да включва най-малко три единици. По-късно е доказано, че такава последователност се състои от три нуклеотида, наречени кодон (триплет). Независимо от това, въпросът кои нуклеотиди са отговорни за включването на коя аминокиселина в протеиновата молекула остава открит до 1961 г.

И в 1961 Маршал Ниренберг и Хайнрих Матей използваха системата за излъчване инвитро. Като шаблон се използва олигонуклеотид. Той съдържаше само остатъци от урацил, а синтезираният от него пептид включваше само аминокиселината фенилаланин. Така за първи път е установено значението на кодона: UUU кодонът кодира фенилаланин. Областта на Хар Корана установи, че нуклеотидната последователност UCUCUCUCUCUC кодира набор от аминокиселини серин-левцин-серин-левцин. Като цяло, благодарение на работата на Ниренберг и Корана, до 1965 година генетичният код е напълно разгадан. Оказа се, че всеки триплет кодира определена аминокиселина. И редът на кодоните определя реда на аминокиселините в протеина.

Основните принципи на функциониране на протеините и нуклеиновите киселини са формулирани в началото на 70-те години. Записано е, че синтезът на протеини и нуклеинови киселини се извършва с помощта на шаблонен механизъм. Матричната молекула носи кодирана информация за последователността на аминокиселините или нуклеотидите. По време на репликация или транскрипция, ДНК служи като шаблон; по време на транслация и обратна транскрипция, иРНК служи като шаблон.

По този начин бяха създадени предпоставки за формирането на области на молекулярната биология, включително генното инженерство. А през 1972 г. Пол Берг и колегите му разработват технология за молекулярно клониране. Учените са получили първата рекомбинантна ДНК инвитро. Тези изключителни открития формират основата на ново направление в молекулярната биология и 1972 Оттогава годината се счита за рождена дата на генното инженерство.

3. Методи на молекулярната биология

Огромният напредък в изследването на нуклеиновите киселини, структурата на ДНК и биосинтезата на протеини доведе до създаването на редица методи, които са от голямо значение в медицината, селското стопанство и науката като цяло.

След изучаването на генетичния код и основните принципи на съхранение, предаване и прилагане на наследствена информация, специални методи станаха необходими за по-нататъшното развитие на молекулярната биология. Тези методи биха позволили гените да бъдат манипулирани, променяни и изолирани.

Появата на такива методи се случи през 70-те и 80-те години на миналия век. Това даде огромен тласък на развитието на молекулярната биология. На първо място, тези методи са пряко свързани с получаването на гени и тяхното въвеждане в клетките на други организми, както и с възможността за определяне на последователността на нуклеотидите в гените.

3.1. ДНК електрофореза

ДНК електрофорезае основен метод за работа с ДНК. ДНК електрофорезата се използва заедно с почти всички други методи за изолиране на желаните молекули и допълнителен анализ на резултатите. Самият метод на гел електрофореза се използва за разделяне на ДНК фрагменти по дължина.

Преди или след електрофореза гелът се третира с багрила, които могат да се свържат с ДНК. Багрилата флуоресцират под ултравиолетова светлина, създавайки шарка от ивици в гела. За да се определят дължините на ДНК фрагментите, те могат да бъдат сравнени с маркери- набори от фрагменти със стандартни дължини, които се нанасят върху един и същ гел.

Флуоресцентни протеини

Когато се изучават еукариотни организми, е удобно да се използват флуоресцентни протеини като маркерни гени. Генът за първия зелен флуоресцентен протеин ( зелен флуоресцентен протеин, GFP), изолиран от медуза Aqeuorea victoria, след което са въведени в различни организми. След това бяха изолирани гени за флуоресцентни протеини с други цветове: синьо, жълто, червено. За да се получат протеини с интересни свойства, такива гени са изкуствено модифицирани.

Като цяло, най-важните инструменти за работа с ДНК молекулата са ензимите, които извършват редица ДНК трансформации в клетките: ДНК полимерази, ДНК лигазиИ рестрикционни ензими (рестрикционни ендонуклеази).

Трансгенеза

Трансгенезасе нарича трансфер на гени от един организъм в друг. И такива организми се наричат трансгенен.

Рекомбинантните протеинови препарати се произвеждат по метода на генен трансфер в микробни клетки. Основно такива протеинови препарати са интерферони, инсулин, някои протеинови хормони, както и протеини за производството на редица ваксини.

В други случаи се използват клетъчни култури от еукариоти или трансгенни животни, предимно говеда, които отделят необходимите протеини в млякото. По този начин се получават антитела, фактори на кръвосъсирването и други протеини. Методът на трансгенезата се използва за получаване на култивирани растения, които са устойчиви на вредители и хербициди, а отпадъчните води се пречистват с помощта на трансгенни микроорганизми.

В допълнение към всичко по-горе, трансгенните технологии са незаменими в научните изследвания, тъй като развитието на биологията става по-бързо с използването на методи за модификация и трансфер на гени.

Рестрикционни ензими

Последователностите, разпознати от рестрикционните ензими, са симетрични, така че всякакъв вид прекъсвания могат да възникнат или в средата на такава последователност, или с изместване в едната или двете вериги на молекулата на ДНК.

Когато всяка ДНК се смила с рестрикционен ензим, последователностите в краищата на фрагментите ще бъдат същите. Те ще могат да се свържат отново, защото имат допълващи се региони.

Можете да получите една молекула, като съедините тези последователности с помощта на ДНК лигази. Благодарение на това е възможно да се комбинират фрагменти от две различни ДНК и да се получи рекомбинантна ДНК.

3.2. PCR

Методът се основава на способността на ДНК полимеразите да завършат втората верига на ДНК по протежение на комплементарна верига по същия начин, както по време на процеса на репликация на ДНК в клетката.

3.3. ДНК секвениране

Бързото развитие на метода за секвениране дава възможност за ефективно определяне на характеристиките на изследвания организъм на нивото на неговия геном. Основното предимство на такива геномни и постгеномни технологии е повишената способност за изследване и изучаване на генетичната природа на човешките заболявания, за да се вземат необходимите мерки предварително и да се избегнат заболявания.

Чрез широкомащабни изследвания е възможно да се получат необходимите данни за различните генетични характеристики на различни групи хора, като по този начин се разработят медицински методи. Поради това идентифицирането на генетичното предразположение към различни заболявания днес е много популярно.

Подобни методи са широко приложими почти по целия свят, включително и в Русия. Благодарение на научния прогрес такива методи се въвеждат в медицинските изследвания и медицинската практика като цяло.

4. Биотехнология

Биотехнология- дисциплина, която изучава възможностите за използване на живи организми или техните системи за решаване на технологични проблеми, както и създаване на живи организми с желаните свойства чрез генно инженерство. Биотехнологиите прилагат методи на химията, микробиологията, биохимията и, разбира се, молекулярната биология.

Основните насоки на развитие на биотехнологиите (принципите на биотехнологичните процеси се въвеждат в производството на всички индустрии):

1. Създаване и производство на нови видове храни и фуражи.
2. Получаване и изследване на нови щамове микроорганизми.
3. Отглеждане на нови сортове растения, както и създаване на средства за защита на растенията от болести и неприятели.
4. Приложение на биотехнологични методи за екологични нужди. Такива биотехнологични методи се използват за обработване на отпадъци, пречистване на отпадъчни води, ремедиация на отпадъчния въздух и почвата.
5. Производство на витамини, хормони, ензими, серуми за медицински нужди. Биотехнолозите се развиват подобрено лекарствакоито преди се смятаха за нелечими.

Основно постижение на биотехнологиите е генното инженерство.

Генното инженерство- набор от технологии и методи за получаване на рекомбинантни РНК и ДНК молекули, изолиране на отделни гени от клетки, манипулиране на гени и въвеждането им в други организми (бактерии, дрожди, бозайници). Такива организми са способни да произвеждат крайни продукти с желаните, модифицирани свойства.

Методите на генното инженерство са насочени към конструиране на нови, несъществуващи досега комбинации от гени в природата.

Говорейки за постиженията на генното инженерство, не можем да не засегнем темата за клонирането. Клониранее метод на биотехнология, използван за получаване на идентично потомство на различни организми чрез безполово размножаване.

С други думи, клонирането може да се разглежда като процес на създаване на генетично идентични копия на организъм или клетка. А клонираните организми са подобни или дори идентични не само по външни характеристики, но и по генетично съдържание.

Известната овца Доли стана първият бозайник, клониран през 1966 г. Получава се чрез трансплантиране на ядрото на соматична клетка в цитоплазмата на яйцеклетката. Доли беше генетично копие на овцата, която донори клетъчното ядро. При естествени условия индивидът се формира от едно оплодено яйце, като е получил половината от генетичния материал от двама родители. По време на клонирането обаче генетичният материал е взет от клетката на един индивид. Първо, ядрото, което съдържа самата ДНК, е отстранено от зиготата. След това те извличат ядрото от клетката на възрастна овца и го имплантират в тази зигота, лишена от ядро, след което то се трансплантира в матката на възрастен и осигурява възможност за растеж и развитие.

Не всички опити за клониране обаче бяха успешни. Успоредно с клонирането на Доли е проведен експеримент за заместване на ДНК на други 273 яйцеклетки. Но само в един случай живо възрастно животно успя да се развие и расте напълно. След Доли учените се опитаха да клонират и други видове бозайници.

Един от видовете генно инженерство е редактиране на генома.

Инструментът CRISPR/Cas се основава на елемент от имунната защитна система на бактериите, който учените са адаптирали, за да въведат всякакви промени в ДНК на животни или растения.

CRISPR/Cas е един от биотехнологичните методи за манипулиране на отделни гени в клетките. Има огромен брой приложения за тази технология. CRISPR/Cas позволява на изследователите да разберат функцията на различни гени. За да направите това, просто трябва да изрежете интересния ген от ДНК и да проучите кои функции на тялото са засегнати.

някои практически приложениясистеми:

1. Селско стопанство.Системите CRISPR/Cas могат да се използват за подобряване на културите. А именно да ги направим по-вкусни и питателни, както и топлоустойчиви. Възможно е да се дадат на растенията други свойства: например да се изреже алергенен ген от ядки (фъстъци или лешници).
2. Медицина, наследствени болести.Учените имат за цел да използват CRISPR/Cas за премахване на мутации от човешкия геном, които могат да причинят заболявания като сърповидно-клетъчна анемия и т.н. На теория с помощта на CRISPR/Cas е възможно да се спре развитието на ХИВ.
3. Генно шофиране. CRISPR/Cas може да промени не само генома на отделно животно или растение, но и генофонда на даден вид. Тази концепция е известна като "генно шофиране". Всеки жив организъм предава половината от своите гени на своето потомство. Но използването на CRISPR/Cas може да увеличи вероятността за трансфер на гени с до 100%. Това е важно, за да може желаната черта да се разпространи по-бързо в популацията.

Швейцарски учени значително подобриха и модернизираха метода за редактиране на генома CRISPR/Cas, като по този начин разшириха неговите възможности. Учените обаче могат да променят само един ген наведнъж, използвайки системата CRISPR/Cas. Но сега изследователи от ETH Zurich са разработили метод, който може едновременно да модифицира 25 гена в клетка.

За най-новата техника експертите са използвали ензима Cas12a. Генетици успешно клонираха маймуни за първи път в историята. "Популярна механика";

Николенко С. (2012). Геномика: Постановка на проблема и методи за секвениране. "Постнаука".

Молекулярна биология,наука, която има за цел да разбере природата на жизнените явления чрез изучаване на биологични обекти и системи на ниво, доближаващо се до молекулярното ниво, а в някои случаи достигайки тази граница. Крайната цел е да се установи как и до каква степен характерните прояви на живота, като наследственост, размножаване на себеподобните, биосинтеза на протеини, възбудимост, растеж и развитие, съхранение и предаване на информация, енергийни трансформации, мобилност и др. , се определят от структурата, свойствата и взаимодействието на молекулите на биологично важни вещества, предимно два основни класа високомолекулни биополимери - протеини и нуклеинови киселини. Отличителна черта на M. b. - изследване на жизнени явления върху неодушевени обекти или такива, които се характеризират с най-примитивните прояви на живота. Това са биологични образувания от клетъчно ниво и по-долу: субклетъчни органели, като изолирани клетъчни ядра, митохондрии, рибозоми, хромозоми, клетъчни мембрани; по-нататък - системи, които стоят на границата на живата и неживата природа - вируси, включително бактериофаги, и завършващи с молекули на най-важните компоненти на живата материя - нуклеинови киселини и протеини.

Основата, върху която се развива M. b., е положена от такива науки като генетика, биохимия, физиология на елементарните процеси и др. е неразривно свързана с молекулярната генетика, която продължава да бъде важна част

Отличителна черта на M. b. е нейната триизмерност. Същност на M. b. се вижда от M. Perutz за тълкуване на биологичните функции от гледна точка на молекулярната структура. М. б. има за цел да получи отговори на въпроса „как”, като е научил същността на ролята и участието на цялата структура на молекулата, и на въпросите „защо” и „за какво”, като е разбрал, от една страна, връзките между свойствата на молекулата (отново преди всичко белтъци и нуклеинови киселини) и изпълняваните от нея функции и, от друга страна, ролята на тези отделни функции в цялостния комплекс от прояви на живота.

Най-важните постижения на молекулярната биология.Ето един далеч не пълен списък на тези постижения: откриване на структурата и механизма на биологичната функция на ДНК, всички видове РНК и рибозоми, откриване на генетичния код; откриване на обратна транскрипция, т.е. синтез на ДНК върху матрица на РНК; изучаване на механизмите на функциониране на дихателните пигменти; откриване на триизмерната структура и нейната функционална роля в действието на ензимите, принципа на матричния синтез и механизмите на протеиновата биосинтеза; разкриване на структурата на вирусите и механизмите на тяхната репликация, първичната и частично пространствената структура на антителата; изолиране на отделни гени, химически и след това биологичен (ензимен) синтез на ген, включително човешки, извън клетката (ин витро); трансфер на гени от един организъм в друг, включително човешки клетки; бързо напредващото дешифриране на химическата структура на нарастващ брой отделни протеини, главно ензими, както и нуклеинови киселини; откриване на явления на „самосглобяване“ на някои биологични обекти с нарастваща сложност, като се започне от молекулите на нуклеиновата киселина и се стигне до многокомпонентни ензими, вируси, рибозоми и др.; изясняване на алостеричните и други основни принципи на регулация на биологичните функции и процеси.

Проблеми на молекулярната биология.Наред с посочените важни задачи на М. б. (познаване на законите на "разпознаването", самосглобяването и интегрирането) спешна посока на научните изследвания в близко бъдеще е разработването на методи, които правят възможно дешифрирането на структурата, а след това и триизмерната, пространствена организация на високомолекулни нуклеинови киселини. Всички най-важни методи, чието използване осигури появата и успеха на молекулярната биология, бяха предложени и разработени от физици (ултрацентрофугиране, рентгенов дифракционен анализ, електронна микроскопия, ядрено-магнитен резонанс и др.). Почти всички нови физични експериментални подходи (например използването на компютри, синхротронно или спирачно лъчение, лазерна технология и др.) разкриват нови възможности за задълбочено проучванепроблеми М. б. Сред най-важните практически проблеми, чийто отговор се очаква от M. b., на първо място е проблемът за молекулярната основа на злокачествения растеж, след това - начините за предотвратяване и може би преодоляване на наследствените заболявания - „молекулярни заболявания ”. Изясняването на молекулярната основа на биологичната катализа, т.е. действието на ензимите, ще бъде от голямо значение. Сред най-важните съвременни тенденции в M. b. трябва да включва желанието да се дешифрират молекулярните механизми на действие на хормони, токсични и лекарствени вещества, както и да се открият подробности за молекулярната структура и функционирането на такива клетъчни структури като биологични мембрани, участващи в регулирането на процесите на проникване и транспорт на вещества. По-далечни цели на М. б. - познаване на природата на нервните процеси, механизмите на паметта и др. Един от важните нововъзникващи раздели на M. b. - т.нар генно инженерство, което има за цел да управлява целенасочено генетичния апарат (генома) на живите организми, от микроби и низши (едноклетъчни) организми до човека (в последния случай предимно с цел радикално лечение на наследствени заболявания и корекция на генетичните дефекти).

Най-важните области на MB:

– Молекулярна генетика – изследване на структурната и функционална организация на генетичния апарат на клетката и механизма за реализиране на наследствената информация

– Молекулярна вирусология – изследване на молекулярните механизми на взаимодействие на вирусите с клетките

– Молекулярна имунология – изследване на моделите на имунните реакции на организма

– Молекулярна биология на развитието – изследване на появата на различни по качество клетки по време на индивидуалното развитие на организмите и клетъчната специализация

Основни обекти на изследване: Вируси (включително бактериофаги), Клетки и субклетъчни структури, Макромолекули, Многоклетъчни организми.

Молекулярна биология / mə лɛ Да сеДжʊ лər / е клон на биологията, който се занимава с молекулярната основа на биологичната активност между биомолекулите в различни клетъчни системи, включително взаимодействията между ДНК, РНК, протеини и тяхната биосинтеза, както и регулирането на тези взаимодействия. Запиши се за природапрез 1961 г. Астбъри описва молекулярната биология:

Не толкова техника, колкото подход, подход от гледна точка на така наречените фундаментални науки с водеща идея за търсене под мащабните прояви на класическата биология за съответната молекулярна равнина. Той е загрижен по-специално за формибиологични молекули и [...] предимно триизмерни и структурни – което обаче не означава, че това е просто усъвършенстване на морфологията. Той трябва в същото време да изследва генезиса и функциите.

Връзка с други биологични науки

Изследователите в областта на молекулярната биология използват специфични техники от молекулярната биология, но все повече ги комбинират с методи и идеи от генетиката и биохимията. Няма ясна граница между тези дисциплини. Това е илюстрирано в следната диаграма, която изобразява един възможен вид връзка между полета:

• Биохимия е изследване на химикали и жизненоважни процеси, протичащи в живите организми. Биохимиците трудно се фокусират върху ролята, функцията и структурата на биомолекулите. Изследването на химията зад биологичните процеси и синтеза на биологично активни молекули са примери за биохимия.
• Генетика е изследване на влиянието на генетичните различия в организмите. Това често може да се заключи от липсата на нормален компонент (напр. един ген). Изследването на "мутанти" са организми, които имат един или повече функционални компоненти по отношение на така наречения "див тип" или нормален фенотип. Генетичните взаимодействия (епистаза) често объркват прости интерпретации на такива „нокаут“ изследвания.
• Молекулярна биология е изследване на молекулярната основа на процесите на репликация, транскрипция, транслация и клетъчна функция. Централната догма на молекулярната биология, където генетичният материал се транскрибира в РНК и след това се транслира в протеин, макар и твърде опростена, все пак предоставя добра отправна точка за разбиране на областта. Картината е преразгледана в светлината на възникващите нови роли за РНК.

Методи на молекулярната биология

Молекулярно клониране

Една от най-основните техники на молекулярната биология за изучаване на протеиновата функция е молекулярното клониране. При тази техника ДНК, кодираща протеина, който представлява интерес, се клонира с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR) и/или рестрикционни ензими в плазмид (експресионен вектор). Вектор има 3 отличителни черти: произход на репликация, сайт за множествено клониране (MCS) и избираем маркер, обикновено за антибиотична резистентност. Нагоре по веригата на мястото на множествено клониране са регионите на промотора и началния сайт на транскрипция, които регулират експресията на клонирания ген. Този плазмид може да бъде вмъкнат както в бактериални, така и в животински клетки. Въвеждане на ДНК в бактериални клеткиможе да се направи чрез трансформация чрез поглъщане на гола ДНК, конюгация чрез клетъчно-клетъчни контакти или чрез трансдукция с вирусен вектор. Въвеждането на ДНК в еукариотни клетки, като животински клетки, чрез физически или химически средства се нарича трансфекция. Налични са няколко различни метода за трансфекция, като трансфекция с калциев фосфат, електропорация, микроинжекция и липозомна трансфекция. Плазмидът може да бъде интегриран в генома, което води до стабилна трансфекция, или може да остане независим от генома, наречени транзиенти на трансфекция.

ДНК, кодираща протеините, представляващи интерес, вече е вътре в клетката и протеините вече могат да бъдат експресирани. Разнообразие от системи като индуцируеми промотори и специфични клетъчни сигнални фактори, които ще помогнат за изразяване на протеинов интерес на високи нива. След това големи количества от протеина могат да бъдат извлечени от бактериалната или еукариотната клетка. Един протеин може да бъде тестван за ензимна активност при различни ситуации, протеинът може да бъде кристализиран, така че неговата третична структура да може да бъде изследвана, или във фармацевтичната индустрия може да се изследва активността на нови лекарства срещу протеина.

Полимеразна верижна реакция

Блотиране и изследване на макромолекулите

Условия северен , западИ ориенталски blotting произлиза от това, което първоначално беше шега на молекулярната биология, която играеше на термина Southernnet, следвайки техниката, описана от Edwin Southern за BLOTTED DNA хибридизация. Патриша Томас, разработчик на РНК блотирането, което след това стана известно като северно - попиване, наистина не използвайте този термин.

Southern blotting

Наречен на своя изобретател, биолога Едуин Садърн, Southern blot е метод за тестване за наличието на специфична ДНК последователност в ДНК проба. ДНК пробите преди или след смилане с рестрикционен ензим (рестриктазен ензим) се разделят чрез гел електрофореза и след това се прехвърлят върху мембрана чрез попиване с помощта на капилярно действие. След това мембраната се излага на белязана ДНК сонда, която има базова последователност, комплементарна на последователността на интересуващата ни ДНК. Southern blotting е по-малко използван в научната лаборатория поради способността на други методи, като PCR, да откриват специфични ДНК последователности от ДНК проби. Тези петна обаче все още се използват за някои приложения, като например измерване на броя на трансгенните копия в трансгенни мишки или в генно инженерство нокаутирани ембрионални стволови клетъчни линии.

Northern blotting

Northern blot диаграма

Източно петно

Клиничните изследвания и медицинските лечения, произтичащи от молекулярната биология, са частично обхванати от генната терапия. Приложението на молекулярната биология или подходите на молекулярната клетъчна биология към медицината сега се нарича молекулярна медицина. Молекулярната биология също играе важна роля в разбирането на образуването, действията и регулациите на различни части от клетките, които могат да се използват за ефективно насочване към нови лекарства, диагностициране на заболяване и разбиране на клетъчната физиология.

Допълнителна информация

• Cohen, S.N., Chang, N.K.D., Boyer, H. & Heling, R.B. Конструиране на биологично функционални бактериални плазмиди инвитро .