מקצוע ביולוג מולקולרי. ביולוגיה מולקולרית יישומית. א). ספרות ראשית

1. הקדמה.

נושא, משימות ושיטות של ביולוגיה מולקולרית וגנטיקה. משמעות הגנטיקה והגנטיקה ה"קלאסית" של מיקרואורגניזמים בפיתוח ביולוגיה מולקולרית והנדסה גנטית. מושג הגן בגנטיקה "קלאסית" ומולקולרית, האבולוציה שלו. תרומת מתודולוגיה של הנדסה גנטית לפיתוח גנטיקה מולקולרית. ערך יישומי של הנדסה גנטית לביוטכנולוגיה.

2. בסיסים מולקולריים של תורשה.

מושג התא, ההרכב המקרומולקולרי שלו. אופי החומר הגנטי. היסטוריה של עדויות לתפקוד הגנטי של ה-DNA.

2.1. סוגים שונים של חומצות גרעין.פונקציות ביולוגיות של חומצות גרעין. מבנה כימי, מבנה מרחבי ו תכונות גשמיותחומצות גרעין. מאפיינים מבניים של החומר הגנטי של פרו-אוקריוטים. זוגות בסיסים משלימים של ווטסון-קריק. קוד גנטי. היסטוריה של פענוח קוד גנטי. המאפיינים העיקריים של הקוד: שלישייה, קוד ללא פסיקים, ניוון. תכונות של מילון הקוד, משפחות של קודונים, קודונים סמנטיים ו"חסרי משמעות". מולקולות DNA מעגליות והמושג של סלילת-על DNA. טופואיזומרים של DNA וסוגיהם. מנגנוני פעולה של טופואיזומראזים. גיראז של DNA חיידקי.

2.2. שעתוק DNA.פולימראז RNA פרוקריוטי, תת-היחידה והמבנים התלת מימדיים שלו. מגוון גורמי סיגמא. מקדם גנים פרוקריוטי, האלמנטים המבניים שלו. שלבים של מחזור התמלול. ייזום, יצירת "קומפלקס פתוח", התארכות וסיום התמלול. הנחתת תמלול. ויסות של ביטוי טריפטופן אופרון. "ריבוסוויצ'ים". מנגנוני סיום תמלול. ויסות שלילי וחיובי של תמלול. אופרון לקטוז. ויסות שעתוק בהתפתחות פאג למבדה. עקרונות של זיהוי DNA על ידי חלבונים רגולטוריים (CAP חלבון ומדכא פאג למבדה). תכונות של תעתיק באוקריוטים. עיבוד RNA באוקריוטים. מכסה, שחבור ופוליאדנילציה של תמלילים. מנגנוני שחבור. תפקידם של RNA גרעיני קטן וגורמי חלבון. שחבור אלטרנטיבי, דוגמאות.

2.3. מִשׁדָר, שלביו, תפקוד הריבוזומים. מיקום הריבוזומים בתא. סוגים פרוקריוטיים ואוקריוטיים של ריבוזומים; 70S ו-80S ריבוזומים. מורפולוגיה של ריבוזומים. חלוקה לתת-חלקיקים (יחידות משנה). קישור תלוי קודון של aminoacyl-tRNA במחזור ההתארכות. אינטראקציה של קודון-אנטיקודון. השתתפות של גורם ההתארכות EF1 (EF-Tu) בקשירה של aminoacyl-tRNA לריבוזום. גורם התארכות EF1B (EF-Ts), תפקידו, רצף התגובות בהשתתפותו. אנטיביוטיקה המשפיעה על שלב הקישור התלוי בקודון של aminoacyl-tRNA לריבוזום. אנטיביוטיקה אמינוגליקוזיד (סטרפטומיצין, ניומיצין, קנאמיצין, גנטמיצין וכו'), מנגנון הפעולה שלהן. טטרציקלינים כמעכבים של קשירת aminoacyl-tRNA לריבוזום. ייזום שידור. השלבים העיקריים של תהליך החניכה. התחלת תרגום בפרוקריוטים: גורמי ייזום, קודוני ייזום, קצה 3¢ של תת-היחידה הריבוזומלית הקטנה של RNA ורצף Shine-Dalgarno ב-mRNA. התחלת תרגום באאוקריוטים: גורמי ייזום, קודונים ייזום, אזור 5¢ לא מתורגם והתחלה סופנית תלוית כובע. חניכה "פנימית" בלתי תלויה בכובע באוקריוטים. טרנספפטידציה. מעכבי טרנספפטידציה: chloramphenicol, lincomycin, amicetin, streptogramins, anisomycin. מעבר - מקום. מעורבות של גורם התארכות EF2 (EF-G) ו-GTP. מעכבי טרנסלוקציה: חומצה פוסידית, ויומיצין, מנגנוני הפעולה שלהם. סיום תרגום. קודוני סיום. גורמי סיום חלבון של פרוקריוטים ואיקריוטים; שני סוגים של גורמי סיום ומנגנוני פעולתם. ויסות תרגום בפרוקריוטים.

2.4. שכפול הדנ"אוהשליטה הגנטית שלו. פולימראזות המעורבות בשכפול, מאפייני הפעילות האנזימטית שלהם. נאמנות DNA. תפקידן של אינטראקציות סטריות בין זוגות בסיסים של DNA במהלך שכפול. E. coli פולימראזות I, II ו-III. יחידות משנה פולימראז III. מזלג שכפול, חוטים "מובילים" ו"מאחרים" במהלך השכפול. שברים של האוקאזאקי. קומפלקס של חלבונים במזלג השכפול. ויסות התחלת שכפול ב-E. coli. הפסקת שכפול בחיידקים. תכונות של ויסות שכפול פלסמיד. שכפול טבעת דו כיוונית ומתגלגלת.

2.5. ריקומבינציה, סוגיו ודגמיו. רקומבינציה כללית או הומולוגית. שברים כפולים ב-DNA שמתחילים רקומבינציה. תפקיד הרקומבינציה בתיקון לאחר שכפול של הפסקות גדילים כפולים. מבנה הולידיי במודל הרקומבינציה. אנזימולוגיה של רקומבינציה כללית ב-E. coli. קומפלקס RecBCD. חלבון רקה. תפקיד הרקומבינציה בהבטחת סינתזת DNA בנזק ל-DNA המפריע לשכפול. רקומבינציה באוקריוטים. אנזימי רקומבינציה באאוקריוטים. קומבינציה ספציפית לאתר. הבדלים במנגנונים המולקולריים של רקומבינציה כללית וספציפית לאתר. סיווג של רקומבינאזים. סוגי סידורים כרומוזומליים המבוצעים במהלך ריקומבינציה ספציפית לאתר. תפקיד רגולטורי של רקומבינציה ספציפית לאתר בחיידקים. בנייה של כרומוזומים איקריוטיים רב-תאיים באמצעות מערכת ריקומבינציית פאג ספציפית לאתר.

2.6. תיקון DNA.סיווג סוגי הפיצויים. תיקון ישיר של דימרי תימין וגואנין מתיל. חיתוך בסיסים. גליקוזילאזים. מנגנון התיקון של נוקלאוטידים לא מזווגים (תיקון אי התאמה). בחירת גדיל ה-DNA לתיקון. תיקון SOS. מאפיינים של פולימראזות DNA המעורבים בתיקון SOS בפרוקריוטים ובאוקריוטים. המושג "מוטציות אדפטיביות" בחיידקים. תיקון של הפסקות גדילים כפולים: רקומבינציה הומולוגית פוסט-רפליקטיבית ואסוציאציה של קצוות לא הומולוגיים של מולקולת ה-DNA. הקשר בין תהליכי שכפול, ריקומבינציה ותיקון.

3. תהליך מוטציה.

תפקידם של מוטנטים ביוכימיים ביצירת התיאוריה של גן אחד - אנזים אחד. סיווג מוטציות. מוטציות נקודתיות וסידורים כרומוזומליים מחדש, מנגנון היווצרותן. מוטגנזה ספונטנית ומושרה. סיווג של מוטגנים. מנגנון מולקולרי של מוטגנזה. קשר בין מוטגנזה לתיקון. זיהוי ובחירה של מוטנטים. דיכוי: תוך-גני, בין-גני ופנוטיפי.

4. יסודות גנטיים חוץ כרומוזומליים.

פלסמידים, מבנהם וסיווגם. גורם מין F, מבנהו ומחזור החיים שלו. תפקידו של פקטור F בגיוס העברת כרומוזומים. היווצרות תורמים מסוג Hfr ו-F. מנגנון צימוד. בקטריופאג'ים, מבנהם ומחזור חייהם. בקטריופאג'ים ארסיים וממוזגים. ליזוגניה והתמרה. טרנסדוקציה כללית וספציפית. נדידה אלמנטים גנטיים: טרנספוזונים ורצפי IS, תפקידם במטבוליזם גנטי. DNA. -טרנספוזונים בגנום של פרוקריוטים ואיקריוטים רצפי IS של חיידקים, מבנהם רצפי IS כמרכיב של פקטור ה-F של חיידקים, הקובע את היכולת להעביר חומר גנטי בזמן צימוד טרנספוזונים של חיידקים ואורגניזמים איקריוטיים ישיר לא- מנגנונים רפליקטיביים ושכפולים של טרנספוזיציות הרעיון של העברת טרנספוזונים אופקית ותפקידם בסידורים מחדש מבניים (רקומבינציה אקטופית) ובאבולוציה של הגנום.

5. חקר המבנה והתפקוד של הגן.

אלמנטים של ניתוח גנטי. מבחן השלמה Cis-trans. מיפוי גנטי באמצעות צימוד, התמרה וטרנספורמציה. בניית מפות גנטיות. מיפוי גנטי משובח. ניתוח פיזי של מבנה הגן. ניתוח הטרודופלקס. ניתוח הגבלה. שיטות רצף. תגובת שרשרת פולימראז. חשיפת תפקידו של גן.

6. ויסות ביטוי גנים. מושגים של אופרון ורגולון. בקרה ברמת התחלת תמלול. חלבונים מקדם, מפעיל ומווסת. בקרה חיובית ושליליה של ביטוי גנים. בקרה ברמת הפסקת תמלול. אופרונים מבוקרים בקטבוליטים: מודלים של אופרונים לקטוז, גלקטוז, ערבינוז ומלטוז. אופרונים נשלטי מחליש: דגם של האופרון הטריפטופן. ויסות רב ערכי של ביטוי גנים. מערכות גלובליות של רגולציה. תגובה רגולטורית ללחץ. בקרה לאחר התמלול. הולכת אותות. ויסות בתיווך RNA: RNAs קטנים, RNAs חיישנים.

7. יסודות ההנדסה הגנטית. אנזימי הגבלה ושינויים. בידוד ושיבוט של גנים. וקטורים לשיבוט מולקולרי. עקרונות בניית DNA רקומביננטי והכנסתם לתאי המקבל. היבטים יישומיים של הנדסה גנטית.

א). ספרות עיקרית:

1. Watson J., Tooze J., DNA Recombinant: A Brief Course. – מ.: מיר, 1986.

2. גנים. – מ.: מיר. 1987.

3. ביולוגיה מולקולרית: מבנה וביוסינתזה של חומצות גרעין. / אד. . - מ. בית ספר תיכון. 1990.

4., - ביוטכנולוגיה מולקולרית. מ' 2002.

5. ריבוזומי ספירין וביוסינתזה של חלבון. - M.: בוגר בית - ספר, 1986.

ב). ספרות נוספת:

1. החסין של הגנום. – מ.: מדע. 1984.

2. ריבצ'ין מהנדסה גנטית. - סנט פטרסבורג: האוניברסיטה הטכנית הממלכתית של סנט פטרסבורג. 1999.

3. גנים של פטרושב. – מ.: נאוקה, 2000.

4. מיקרוביולוגיה מודרנית. פרוקריוטים (ב-2 כרכים). – מ.: מיר, 2005.

5. מ' זינגר, פ' ברג. גנים וגנומים. – מ.: מיר, 1998.

6. שצ'לקונוב הנדסה. - נובוסיבירסק: מסיב. יוניברסיטי, 2004.

7. ביולוגיה סטפנוב. מבנה ותפקודים של חלבונים. - מ.: ו.ש., 1996.

התפתחות הביוכימיה, הביופיזיקה, הגנטיקה, הציטוכימיה, חלקים רבים של מיקרוביולוגיה ווירולוגיה סביב תחילת שנות ה-40 של המאה העשרים. הוביל מקרוב לחקר תופעות חיים ברמה המולקולרית. ההצלחות שהושגו על ידי מדעים אלו, בו זמנית ומצדדים שונים, הובילו להבנה של העובדה שברמה המולקולרית פועלות מערכות הבקרה העיקריות של הגוף וכי המשך ההתקדמות של מדעים אלו תהיה תלויה בחשיפה של הפונקציות הביולוגיות של המולקולות המרכיבות את גופם של אורגניזמים, השתתפותן בסינתזה ופירוק, טרנספורמציות הדדיות ורבייה של תרכובות בתא, כמו גם חילופי אנרגיה ומידע המתרחשים במקרה זה. כך, במפגש של דיסציפלינות ביולוגיות אלה עם כימיה ופיזיקה, צמח ענף חדש לחלוטין - ביולוגיה מולקולרית.

בניגוד לביוכימיה, תשומת הלב של הביולוגיה המולקולרית המודרנית מתמקדת בעיקר בחקר המבנה והתפקוד של המחלקות החשובות ביותר של ביו-פולימרים - חלבונים וחומצות גרעין, שהראשון שבהם קובע את עצם האפשרות לתגובות מטבוליות, והשני - ביוסינתזה של חלבונים ספציפיים. ברור אפוא שאי אפשר לעשות הבחנה ברורה בין ביולוגיה מולקולרית לביוכימיה, הענפים המקבילים של הגנטיקה, המיקרוביולוגיה והווירולוגיה.

הופעתה של הביולוגיה המולקולרית הייתה קשורה קשר הדוק לפיתוח שיטות מחקר חדשות, שכבר נדונו בפרקים הרלוונטיים. לצד התפתחות מיקרוסקופ האלקטרונים ושיטות אחרות של טכניקה מיקרוסקופית, מילאו תפקיד חשוב לשיטות השבר של אלמנטים תאיים שפותחו בשנות ה-50. הם התבססו על שיטות משופרות של צנטריפוגה דיפרנציאלית (A. Claude, 1954). בשלב זה, כבר היו שיטות אמינות למדי לבידוד ופירוק של ביופולימרים. זה כולל, במיוחד, את זה שהוצע על ידי A. Tiselius (1937; פרס נובל, 1948) שיטת חלוקת החלבון באמצעות אלקטרופורזה, שיטות לבידוד וטיהור חומצות גרעין (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky, וכו'). במקביל, פותחו שיטות שונות של ניתוח כרומטוגרפי במעבדות רבות בעולם (A. Martin ו-R. Sing, 1941; פרס נובל, 1952), לאחר מכן השתפרו משמעותית.

ניתוח עקיפות קרני רנטגן שימש שירות רב ערך בפענוח המבנה של ביופולימרים. העקרונות הבסיסיים של ניתוח עקיפות קרני רנטגן פותחו באוניברסיטת קינגס קולג' בלונדון בהנהגתו של W. Bragg על ידי קבוצת חוקרים, שכללה את ג'יי ברנל, א. לונדסדייל, וו. אסטברי, ג'יי רוברטסון ואחרים.

יש להזכיר במיוחד את לימודי הביוכימיה של פרוטופלזמה (1925 - 1929), פרופסור מאוניברסיטת מוסקבה הממלכתית A.R. Kizel, אשר היו בעלי חשיבות רבה להתפתחותה של הביולוגיה המולקולרית. קיזל פגע בתפיסה המושרשת היטב שכל פרוטופלזמה מבוססת על גוף חלבוני מיוחד - לוחות, שקובעים לכאורה את כל המאפיינים המבניים והתפקודיים החשובים ביותר שלו. הוא הראה שצלחות הן חלבון שנמצא רק ב-myxomycetes, ולאחר מכן בשלב מסוים של התפתחות, ושאף מרכיב קבוע - חלבון שלד בודד - לא קיים בפרוטופלזמה. לפיכך, חקר בעיית מבנה הפרוטופלזמה והתפקיד התפקודי של חלבונים עשה את הדרך הנכונה וקיבל מרחב לפיתוחה. המחקר של קיסל זכה להכרה עולמית, והמריץ את חקר הכימיה של החלקים המרכיבים את התא.

המונח "ביולוגיה מולקולרית", בשימוש לראשונה על ידי הקריסטלוגרף האנגלי פרופסור מאוניברסיטת לידס וו. אסטברי, הופיע כנראה בתחילת שנות ה-40 (לפני 1945). המחקרים הבסיסיים של עקיפות קרני רנטגן של חלבונים ודנ"א, שבוצעו על ידי אסטברי בשנות השלושים של המאה הקודמת, שימשו כבסיס לפענוח המוצלח שלאחר מכן של המבנה המשני של הביופולימרים הללו. בשנת 1963 כתב ג'יי ברנאל: "אנדרטה לו תוקם על ידי כל הביולוגיה המולקולרית - המדע שהוא שם ויסד באמת" * , בספרות הופיע המונח הזה לראשונה, אולי, ב-1946 במאמרו של W. Astbury "התקדמות בניתוח דיפרקציית רנטגן של תרכובות אורגניות ופיברילריות", שפורסם בכתב העת האנגלי "Nature" ** . בהרצאת הארווי שלו, Astbury (1950) ציין: "אני שמח שהמונח ביולוגיה מולקולרית נמצא כעת בשימוש נרחב למדי, אם כי לא סביר שהייתי הראשון שהציע אותו. אהבתי אותו וניסיתי זמן רב להפיץ אותו. "***. כבר ב-1950 היה ברור לאסטברי שהביולוגיה המולקולרית עוסקת בעיקר במבנה ובקונפורמציה של מקרומולקולות, שלמחקרן יש חשיבות מכרעת להבנת תפקודם של אורגניזמים חיים.

* (ביוגר. מ. עמיתים רועי. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (W.T. Astbury. התקדמות ניתוח רנטגן של מבנים אורגניים וסיבים.- טבע,. 1946, v. 157, 121.)

*** (W.T. Astbury. הרפתקאות בביולוגיה מולקולרית. תומאס ספרינגפילד, 1952, עמ'. 3.)

הביולוגיה המולקולרית עמדה ועומדת, למעשה, עם אותן משימות כמו הביולוגיה כולה – הכרת מהות החיים ותופעות היסוד שלהן, בפרט, כמו תורשה ושונות. הביולוגיה המולקולרית המודרנית נועדה בראש ובראשונה לפענח את המבנה והתפקוד של הגנים, את הדרכים והמנגנונים למימוש המידע הגנטי של אורגניזמים בשלבים שונים של אונטוגנזה ובשלבים שונים של קריאתו. הוא נועד לחשוף את המנגנונים העדינים של ויסות פעילות גנים והתמיינות תאים, כדי להבהיר את אופי המוטגנזה ואת הבסיס המולקולרי של התהליך האבולוציוני.

ביסוס התפקיד הגנטי של חומצות גרעין

לפיתוח הביולוגיה המולקולרית, הגילויים הבאים היו בעלי החשיבות הגדולה ביותר. בשנת 1944, החוקרים האמריקאים O. Avery, K. McLeod (פרס נובל, 1923) ו-M. McCarthy הראו שלמולקולות DNA שבודדו מפנאומוקוקים יש פעילות משתנה. לאחר הידרוליזה של DNAs אלה על ידי deoxyribonuclease, פעילות ההמרה שלהם נעלמה לחלוטין. כך, לראשונה, הוכח באופן משכנע כי מדובר ב-DNA, ולא בחלבון, שניחן בתפקודים גנטיים בתא.

למען ההגינות, יש לציין כי תופעת הטרנספורמציה של חיידקים התגלתה הרבה יותר מוקדם מגילוים של אייברי, מקלאוד ומקארתי. בשנת 1928 פרסם F. Griffith מאמר בו דיווח כי לאחר הוספת תאים מומתים של זן ארסי מובלע לפנאומוקוקים לא ארסיים (לא מובלעים), תערובת התאים שנוצרת הופכת קטלנית עבור עכברים. יתרה מכך, תאי פנאומוקוק חיים שבודדו מבעלי חיים שנדבקו בתערובת זו כבר היו ארסיים והחזיקו בקפסולת פוליסכריד. כך, בניסוי זה, הוכח כי בהשפעת חלק מהמרכיבים של תאי הפנאומוקוק המומתים, הצורה הלא-מובלעת של חיידקים הופכת לצורה ארסית יוצרת קפסולה. 16 שנים מאוחר יותר, אייברי, מקלאוד ומקארת'י החליפו בניסוי זה תאי פנאומוקוק שלמים נהרגים בחומצה הדאוקסיריבונוקלאית שלהם והראו שזהו ה-DNA שיש לו פעילות משתנה (ראה גם פרקים 7 ו-25). קשה להפריז במשמעות הגילוי הזה. זה עורר את חקר חומצות הגרעין במעבדות רבות ברחבי העולם ואילץ מדענים להתמקד ב-DNA.

יחד עם גילוים של אייברי, מקלאוד ומקרתי, בתחילת שנות החמישים, כבר הצטברה כמות די גדולה של עדויות ישירות ועקיפות לכך שחומצות גרעין ממלאות תפקיד יוצא דופן בחיים ונושאות תפקיד גנטי. זה, במיוחד, הצביע על אופי הלוקליזציה של ה-DNA בתא והנתונים של R. Vendrelli (1948) שתכולת ה-DNA לתא היא קבועה לחלוטין ומתאם עם מידת הפלואידה: בתאי נבט הפלואידים, ה-DNA הוא חצי מזה בתאים סומטיים דיפלואידים. היציבות המטבולית המובהקת של ה-DNA העידה גם היא לטובת תפקידו הגנטי של ה-DNA. עד תחילת שנות ה-50 הצטברו הרבה עובדות שונות, המצביעות על כך שרוב הגורמים המוטגנים הידועים פועלים בעיקר על חומצות גרעין ובפרט על DNA (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 ואחרים).

חשיבות מיוחדת בביסוס התפקיד הגנטי של חומצות גרעין היה חקר הפאג'ים והנגיפים השונים. בשנת 1933, ד. שלזינגר מצא DNA בבקטריופאג של Escherichia coli. מאז בידוד נגיף פסיפס הטבק (TMV) במצב הגבישי על ידי וו. סטנלי (1935, פרס נובל, 1946), החל שלב חדש בחקר נגיפי הצמח. בשנים 1937 - 1938. עובדי התחנה החקלאית ברוטאמסטד (אנגליה) F. Bowden ו- N. Pirie הראו כי נגיפים צמחיים רבים המבודדים על ידם אינם גלובולינים, אלא הם ריבונוקלאופרוטאין ומכילים חומצת גרעין כמרכיב חובה. ממש בתחילת שנות ה-40 פורסמו יצירותיהם של G. Schramm (1940), P. A. Agatov (1941), G. Miller and W. Stanley (1941), מה שהצביע על כך ששינוי כימי בולט של רכיב החלבון אינו מוביל. לאובדן זיהום TMV. זה הצביע על כך שמרכיב החלבון אינו יכול להיות הנשא של התכונות התורשתיות של הנגיף, כפי שמיקרוביולוגים רבים המשיכו להאמין. עדויות משכנעות לטובת התפקיד הגנטי של חומצת גרעין (RNA) בנגיפים צמחיים הושגו בשנת 1956 על ידי G. Schramm ב-Tübingen (FRG) ו-H. Frenkel-Konrath בקליפורניה (ארה"ב). חוקרים אלו בודדו כמעט בו-זמנית וללא תלות זה בזה RNA מ-TMV והראו כי לו, ולא לחלבון, יש זיהום: כתוצאה מהדבקה של צמחי טבק ב-RNA זה, נוצרו והתרבו בהם חלקיקים ויראליים תקינים. המשמעות היא ש-RNA הכיל מידע לסינתזה והרכבה של כל הרכיבים הנגיפיים, כולל החלבון הנגיפי. בשנת 1968, I. G. Atabekov קבע כי לחלבון יש תפקיד משמעותי בעצם ההדבקה של צמחים - אופי החלבון קובע את הספקטרום של הצמחים המארחים.

בשנת 1957 ביצעה פרנקל-קונרט לראשונה את שחזור ה-TMV מהמרכיבים המרכיבים אותו - RNA וחלבון. יחד עם חלקיקים רגילים, הוא קיבל "כלאיים" מעורבים שבהם ה-RNA היה מזן אחד והחלבון מזן אחר. התורשה של הכלאיים כאלה נקבעה לחלוטין על ידי RNA, וצאצאיהם של הנגיפים היו שייכים לזן שה-RNA שלו שימש להשגת החלקיקים המעורבים הראשוניים. מאוחר יותר, הניסויים של A. Gierer, G. Schuster and G. Schramm (1958) ו-G. Witman (1960 - 1966) הראו שהשינוי הכימי של רכיב הגרעין TMV מוביל להופעת מוטנטים שונים של נגיף זה.

בשנת 1970, D. Baltimore ו-G. Temin מצאו שהעברת מידע גנטי יכולה להתרחש לא רק מ-DNA ל-RNA, אלא להיפך. הם מצאו בכמה וירוסים המכילים RNA אונקוגניים (נגיפי אונקורנה) אנזים מיוחד, מה שנקרא ה-Reverse transcriptase, המסוגל לסנתז DNA משלים על שרשראות RNA. תגלית מרכזית זו אפשרה להבין את מנגנון החדרת המידע הגנטי של וירוסים המכילים RNA לגנום המארח ולהסתכל מחדש על אופי הפעולה האונקוגנית שלהם.

גילוי חומצות גרעין וחקר תכונותיהן

המונח חומצות גרעין הוצג על ידי הביוכימאי הגרמני ר' אלטמן ב-1889, לאחר שתרכובות אלו התגלו ב-1869 על ידי הרופא השוויצרי פ. מישר. מישר חילץ את תאי המוגלה עם חומצה הידרוכלורית מדוללת במשך מספר שבועות והשיג חומר גרעיני כמעט טהור בשאר. הוא ראה בחומר הזה חומר אופייני לגרעיני התא וקרא לו גרעין. מבחינת תכונותיו, הגרעין היה שונה מאוד מחלבונים: הוא היה חומצי יותר, לא הכיל גופרית, אבל הכיל הרבה זרחן, הוא היה מסיס בקלות באלקליות, אך לא מתמוסס בחומצות מדוללות.

מישר שלח את תוצאות תצפיותיו על גרעין לפ. גופה-סיילר לפרסום בכתב עת. החומר שתיאר היה כל כך חריג (באותה תקופה היה ידוע רק לציטין מכל התרכובות המכילות זרחן ביולוגי) עד שגופה-סיילר לא האמין לניסויים של מישר, החזיר לו את כתב היד והורה לעובדיו נ.פלוש ונ.ליובבין בדוק את המסקנות שלו על חומר אחר. עבודתו של מישר "על ההרכב הכימי של תאי מוגלה" פורסמה שנתיים לאחר מכן (1871). במקביל, התפרסמו יצירותיהם של גופה-סיילר ומשתפי הפעולה שלו על הרכב תאי מוגלה, אריתרוציטים של ציפורים, נחשים ותאים אחרים. במהלך שלוש השנים הבאות, גרעין בודד מתאי בעלי חיים ושמרים.

בעבודתו ציין מישר כי מחקר מפורט של גרעינים שונים יכול להוביל לביסוס הבדלים ביניהם, ובכך לצפות את רעיון הספציפיות של חומצות גרעין. תוך כדי לימוד חלב סלמון, מישר גילה שהגרעין שבהם הוא בצורת מלח וקשור לחלבון העיקרי, שאותו כינה פרוטמין.

בשנת 1879 החל א. קוסל לחקור גרעינים במעבדה של גופה-סיילר. ב-1881 הוא בודד היפוקסנטין מגרעין, אך באותה תקופה הוא עדיין פקפק במקורו של הבסיס הזה והאמין שהיפוקסנטין יכול להיות תוצר של פירוק חלבון. בשנת 1891, בין תוצרי הידרוליזה של גרעין, גילה קוסל את אדנין, גואנין, חומצה זרחתית וחומר נוסף בעל תכונות של סוכר. עבור מחקר על הכימיה של חומצות גרעין, זכה קוסל בפרס נובל בשנת 1910.

התקדמות נוספת בפענוח המבנה של חומצות גרעין קשורה למחקר של פ' לוין ועמיתיו (1911 - 1934). ב-1911 זיהו פ' לוין ו-ג'ייקובס את המרכיב הפחמימתי של אדנוזין וגואנוזין; הם גילו שהנוקלאוזידים האלה מכילים D-ribose. בשנת 1930, לוין הראה שמרכיב הפחמימות של ה-deoxyribonucleosides הוא 2-deoxy-D-ribose. מעבודתו נודע כי חומצות גרעין בנויות מנוקלאוטידים, כלומר נוקלאוזידים מזורחים. לוין האמין שהסוג העיקרי של הקשר בחומצות גרעין (RNA) הוא הקשר הפוספודיסטר בגודל 2", 5". התפיסה הזו התבררה כשגויה. הודות לעבודתם של הכימאי האנגלי א' טוד (פרס נובל, 1957) ומשתפי הפעולה שלו, כמו גם הביוכימאים האנגלים ר' מרקהאם וג'יי סמית', נודע בתחילת שנות ה-50 שהסוג העיקרי של הקשר ב-RNA הוא 3", 5" - קשר פוספודיסטר.

לוין הראה כי חומצות גרעין שונות יכולות להיות שונות באופי של מרכיב הפחמימות: חלקן מכילות את הסוכר דאוקסיריבוז, בעוד אחרות מכילות ריבוז. בנוסף, שני סוגי חומצות גרעין אלו נבדלו באופיים של אחד הבסיסים: חומצות גרעין מסוג פנטוז הכילו אורציל, וחומצות גרעין מסוג דאוקסיפנטוז הכילו תימין. חומצת גרעין דאוקסיפנטוזה (במינוח המודרני, חומצה דאוקסיריבונוקלאית - DNA) בודדה בדרך כלל בקלות בכמויות גדולות מהתימוס (הבלוטה המתוקה) של העגלים. לכן, זה נקרא חומצה תימונוקלאית. המקור לחומצת גרעין מסוג פנטוז (RNA) היה בעיקר שמרים ונבט חיטה. סוג זה נקרא לעתים קרובות חומצת גרעין שמרים.

בתחילת שנות ה-30, התפיסה שתאי צמחים מאופיינים בחומצת גרעין מסוג שמרים הייתה מושרשת למדי, בעוד שחומצה תימונוקלאית אופיינית רק לגרעיני תאי בעלי חיים. שני סוגי חומצות הגרעין, RNA ו-DNA, נקראו אז חומצות גרעין צמחיות ובעלי חיים, בהתאמה. עם זאת, כפי שהראו המחקרים המוקדמים של A. N. Belozersky, חלוקה כזו של חומצות גרעין אינה מוצדקת. ב-1934 גילה בלוז'רסקי לראשונה חומצה תימונוקלאית בתאי צמחים: משתילי אפונה הוא בודד וזיהה את בסיס התימין-פירמידין, האופייני ל-DNA. ואז הוא גילה את הטימין בצמחים אחרים (זרעי סויה, שעועית). בשנת 1936, A. N. Belozersky ו-I. I. Dubrovskaya בודדו DNA באופן הכנה משתילי ערמון סוס. בנוסף, סדרה של מחקרים שבוצעו באנגליה בשנות הארבעים על ידי ד' דוידסון ועמיתיו לעבודה הראו בצורה משכנעת כי חומצת גרעין צמחית (RNA) מצויה בתאי בעלי חיים רבים.

השימוש הנרחב בתגובה הציטוכימית ל-DNA שפותחו על ידי R. Felgen ו-G. Rosenbeck (1924) והתגובה של J. Brachet (1944) ל-RNA אפשרו לפתור במהירות וחד משמעית את סוגיית הלוקליזציה המועדפת של גרעין אלו. חומצות בתא. התברר שה-DNA מרוכז בגרעין, בעוד שה-RNA מרוכז בעיקר בציטופלזמה. מאוחר יותר נמצא ש-RNA כלול גם בציטופלזמה וגם בגרעין, ובנוסף זוהה DNA ציטופלזמי.

באשר לשאלת המבנה הראשוני של חומצות גרעין, עד אמצע שנות ה-40 התבסס היטב הרעיון של פ' לוין במדע, לפיו כל חומצות הגרעין בנויות לפי אותו סוג ומורכבות מאותו מה שנקרא טטרונוקלאוטיד. בלוקים. כל אחד מהבלוקים הללו, לפי לוין, מכיל ארבעה נוקלאוטידים שונים. תיאוריית הטטרונוקלאוטידים של המבנה של חומצות גרעין שללה במידה רבה את הספציפיות של הביופולימרים הללו. לכן, אין זה מפתיע שבאותה תקופה כל הפרטים הספציפיים של יצורים חיים היו קשורים רק לחלבונים, שאופי המונומרים שלהם מגוון הרבה יותר (20 חומצות אמינו).

הפער הראשון בתיאוריה של מבנה הטטרנוקלאוטידים של חומצות גרעין נוצר על ידי הנתונים האנליטיים של הכימאי האנגלי J. Gouland (1945 - 1947). כאשר קבע את הרכב חומצות הגרעין לפי חנקן הבסיס, הוא לא השיג יחס שווה-מולרי של בסיסים, כפי שהיה צריך להיות לפי התיאוריה של לוין. לבסוף, תיאוריית הטטנוקלאוטידים של מבנה חומצות הגרעין קרסה כתוצאה ממחקרם של E. Chargaff ומשתפי הפעולה שלו (1949 - 1951). Chargaff השתמש בכרומטוגרפיה של נייר כדי להפריד את הבסיסים המשתחררים מה-DNA כתוצאה מההידרוליזה החומצית שלו. כל אחד מהבסיסים הללו נקבע בצורה מדויקת מבחינה ספקטרופוטומטרית. Chargaff הבחין בסטיות משמעותיות מהיחס השווה-מולרי של בסיסים ב-DNA ממקורות שונים ולראשונה קבע בהחלט של-DNA יש ספציפיות מינים בולטת. בכך הסתיימה ההגמוניה של מושג הספציפיות של חלבון בתא החי. בניתוח DNA ממקורות שונים, Chargaff גילה וגיבש דפוסים ייחודיים של הרכב DNA, שנכנסו למדע בשם הכללים של Chargaff. על פי כללים אלו, בכל ה-DNA, ללא קשר למקור, כמות האדנין שווה לכמות התימין (A=T), כמות הגואנין שווה לכמות הציטוזין (G=C), כמות פורינים שווה לכמות הפירימידינים (G + A = C + T), כמות הבסיסים עם 6 קבוצות אמינו שווה למספר הבסיסים עם 6 קבוצות קטו (A + C = G + T). עם זאת, למרות התכתבויות כמותיות כה קפדניות, DNA סוגים שוניםנבדלים בגודל היחס A + T: G + C. בחלק מה-DNA, כמות הגואנין והציטוזין גוברת על כמות האדנין והתימין (Chargaff כינה את ה-DNA האלה מסוג GC DNA); DNAs אחרים הכילו יותר אדנין ותימין מאשר גואנין וציטוזין (DNAs אלו נקראו DNA מסוג AT). הנתונים שהושגו על ידי Chargaff על הרכב ה-DNA מילאו תפקיד יוצא דופן בביולוגיה מולקולרית. הם היו אלה שהיוו את הבסיס לגילוי מבנה ה-DNA, שנעשה ב-1953 על ידי ג'יי ווטסון ופ' קריק.

עוד בשנת 1938, W. Astbury ו-F. Bell, באמצעות ניתוח עקיפה של קרני רנטגן, הראו כי מישורי הבסיס ב-DNA צריכים להיות מאונכים לציר הארוך של המולקולה ולהידמות, כביכול, לערימה של לוחות הנמצאים אחד מעל. האחר. עם שיפור הטכניקה של ניתוח עקיפה של קרני רנטגן, עד 1952 - 1953. מידע מצטבר שאפשר לשפוט את אורכם של קשרים בודדים ואת זוויות הנטייה. זה איפשר לייצג בסבירות הגבוהה ביותר את אופי הכיוון של הטבעות של שיירי פנטוז בעמוד השדרה של סוכר-פוספט של מולקולת ה-DNA. בשנת 1952 הציע ס. פרברג שני מודלים ספקולטיביים של DNA, שייצגו מולקולה חד-גדילית מקופלת או מפותלת על עצמה. מודל ספקולטיבי לא פחות של מבנה ה-DNA הוצע ב-1953 על ידי ל' פאולינג (חתן פרס נובל, 1954) ור' קורי. במודל זה, שלושה גדילים מעוותים של DNA יצרו סליל ארוך, שליבתו מיוצגת על ידי קבוצות פוספט, והבסיסים ממוקמים מחוצה לו. עד 1953, M. Wilkins ו-R. Franklin השיגו דפוסי עקיפה ברורים יותר של דנ"א. הניתוח שלהם הראה את הכישלון המוחלט של המודלים של פרברג, פאולינג וקורי. תוך שימוש בנתונים של Chargaff, השוואה בין שילובים שונים של מודלים מולקולריים של מונומרים בודדים ונתוני עקיפה של קרני רנטגן, ג'יי ווטסון ופ. קריק בשנת 1953 הגיעו למסקנה שמולקולת ה-DNA חייבת להיות סליל דו-גדילי. הכללים של Chargaff הגבילו מאוד את מספר השילובים המוסדרים האפשריים של בסיסים במודל ה-DNA המוצע; הם הציעו לווטסון וקריק שחייב להיות זיווג בסיסים ספציפי במולקולת ה-DNA - אדנין עם תימין וגואנין עם ציטוזין. במילים אחרות, אדנין בגדיל אחד של דנ"א תמיד מתאים לתימין בגדיל השני, וגואנין בגדיל אחד בהכרח מתאים לציטוזין בגדיל השני. כך, ווטסון וקריק ניסחו לראשונה את עקרון המבנה המשלים של ה-DNA, בעל חשיבות יוצאת דופן, לפיו גדיל אחד של DNA משלים אחר, כלומר, רצף הבסיסים של גדיל אחד קובע באופן ייחודי את רצף הבסיסים בשני. גדיל (משלים). התברר כי כבר בעצם המבנה של ה-DNA טמון הפוטנציאל להתרבות המדויקת שלו. מודל זה של מבנה DNA מקובל כיום. קריק, ווטסון ווילקינס זכו בפרס נובל בשנת 1962 על פענוח מבנה ה-DNA.

יש לציין כי הרעיון של מנגנון לשעתוק מדויק של מקרומולקולות והעברת מידע תורשתי מקורו בארצנו. בשנת 1927, N. K. Koltsov הציע כי במהלך רביית תאים, רבייה של מולקולות מתרחשת על ידי רבייה אוטוקטליטית מדויקת של מולקולות האב הקיימות. נכון, באותה תקופה קולצוב העניק למאפיין הזה לא מולקולות DNA, אלא מולקולות בעלות אופי חלבוני, שהמשמעות התפקודית שלהן לא הייתה ידועה אז. עם זאת, עצם הרעיון של רבייה אוטוקטליטית של מקרומולקולות ומנגנון העברת תכונות תורשתיות התברר כנבואי: הוא הפך לרעיון המנחה של הביולוגיה המולקולרית המודרנית.

נערך במעבדה של A. N. Belozersky על ידי A. S. Spirin, G. N. Zaitseva, B. F. Vanyushin, S. O. Uryson, A. S. Antonov ועוד מגוון אורגניזמים אשר אישרו באופן מלא את הדפוסים שגילה Chargaff, והתאמה מלאה למודל המולקולרי של מבנה ה-DNA שהציע ווטסון וקריק. מחקרים אלו הראו כי ל-DNA של חיידקים שונים, פטריות, אצות, אקטינומיציטים, צמחים גבוהים, חסרי חוליות וחולייתנים יש הרכב ספציפי. הבדלים בהרכב (התוכן של זוגות AT-base) בולטים במיוחד במיקרואורגניזמים, מתברר כתכונה טקסונומית חשובה. בצמחים ובעלי חיים גבוהים יותר, וריאציות המינים בהרכב ה-DNA בולטות הרבה פחות. אבל זה לא אומר שה-DNA שלהם פחות ספציפי. בנוסף להרכב הבסיסים, הספציפיות נקבעת במידה רבה על ידי הרצף שלהם בשרשראות DNA.

לצד הבסיסים הרגילים, נמצאו בסיסים חנקניים נוספים ב-DNA וב-RNA. לפיכך, G. White (1950) מצא 5-methylcytosine ב-DNA של צמחים ובעלי חיים, וד. Dunn ו-J. Smith (1958) מצאו אדנין מתיל ב-DNA. במשך זמן רב, מתילציטוזין נחשב לסימן היכר של החומר הגנטי של אורגניזמים גבוהים יותר. בשנת 1968, A. N. Belozersky, B. F. Vanyushin ו- N. A. Kokurina מצאו שניתן למצוא אותו גם ב-DNA של חיידקים.

בשנת 1964 גילו מ' גולד וג'יי הורביץ מחלקה חדשה של אנזימים המבצעים את השינוי הטבעי של ה-DNA - המתילציה שלו. לאחר גילוי זה, התברר שבסיסים מינוריים (המוכלים בכמויות קטנות) עולים כבר על שרשרת הפולינוקלאוטידים המוגמרת של DNA כתוצאה מתילציה ספציפית של שיירי ציטוזין ואדנין ברצפים מיוחדים. בפרט, על פי B. F. Vanyushin, Ya. I. Buryanov, ו- A. N. Belozersky (1969), מתילציה של אדנין ב-E. coli DNA יכולה להתרחש בקודונים מסיימים. לפי A.N. Belozersky ועמיתיו (1968 - 1970), וכן M. Meselson (ארה"ב) ו-V. Arber (שוויץ) (1965 - 1969), המתילציה מעניקה תכונות אינדיבידואליות ייחודיות למולקולות ה-DNA, ובשילוב עם הפעולה של נוקלאזות ספציפיות, הוא חלק ממנגנון מורכב השולט בסינתזה של DNA בתא. במילים אחרות, אופי המתילציה של DNA מסוים קובע מראש את השאלה האם הוא יכול להתרבות בתא נתון.

כמעט באותו זמן, החל הבידוד והמחקר האינטנסיבי של מתילאזות DNA ואנדונוקלאזות מגבלות; בשנים 1969 - 1975 רצפי הנוקלאוטידים המוכרים ב-DNA על ידי חלק מהאנזימים הללו הוקמו (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). כאשר DNA שונים עוברים הידרוליזה על ידי אנזים הגבלה, קטעים גדולים למדי עם קצוות "דביקים" זהים מתפצלים החוצה. זה מאפשר לא רק לנתח את מבנה הגנים, כפי שנעשה בנגיפים קטנים (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), אלא גם לבנות גנומים שונים. עם גילוי אנזימי ההגבלה הספציפיים הללו, הנדסה גנטית הפכה למציאות מוחשית. מוטבעים ב-DNA פלסמיד קטן גנים ממקורות שונים כבר מוכנסים בקלות לתאים שונים. לכן, הושג סוג חדש של פלסמידים פעילים ביולוגית, שנותנים עמידות לאנטיביוטיקה מסויימת (S. Cohen, 1973), גנים ריבוזומליים של צפרדע ודרוסופילה הוכנסו לפלסמידים של Escherichia coli (J. Morrow, 1974; X. Boyer, D Hogness, R. Davis, 1974 - 1975). לפיכך, דרכים אמיתיות פתוחות להשגת אורגניזמים חדשים ביסודו על ידי הכנסת ושילוב גנים שונים במאגר הגנים שלהם. גילוי זה יכול להיות מופנה לטובת האנושות כולה.

בשנת 1952, G. White ו-S. Cohen גילו שה-DNA של פאג'ים מסוג T-even מכיל בסיס יוצא דופן - 5-hydroxymethylcytosine. מאוחר יותר, מעבודותיהם של E. Volkin ו-R. Sinsheimer (1954) וכהן (1956), נודע שניתן לגלוקוזידיזציה מלאה או חלקית של שיירי הידרוקסי-מתילציטוזין, וכתוצאה מכך מוגנת מולקולת ה-DNA הפאג מהפעולה ההידרוליטית. של נוקלאזות.

בתחילת שנות ה-50, מיצירותיהם של ד. דאן וג'יי סמית' (אנגליה), ס. זמנהוף (ארה"ב) וא. וואקר (גרמניה), נודע שניתן לכלול אנלוגים רבים של בסיס מלאכותי ב-DNA, ולעתים מחליפים עד 50% תימין. ככלל, תחליפים אלו מובילים לשגיאות בשכפול, בתעתוק ובתרגום של DNA ולהופעת מוטנטים. לפיכך, J. Marmur (1962) מצא שה-DNA של כמה פאגים מכיל אוקסימתילאורציל במקום תימין. בשנת 1963, I. Takahashi ו-J. Marmur גילו שה-DNA של אחד הפאג'ים מכיל אורציל במקום תימין. כך, עיקרון נוסף, לפיו חומצות גרעין הופרדו בעבר, קרס. מאז עבודתו של פ' לוין, מאמינים כי תימין הוא סימן ההיכר של ה-DNA, ואורציל הוא סימן ההיכר של ה-RNA. התברר שלא תמיד סימן זה אמין, וההבדל המהותי באופי הכימי של שני סוגי חומצות הגרעין, כפי שהוא נראה כיום, הוא רק אופי מרכיב הפחמימה.

בחקר הפאג'ים נחשפו מאפיינים יוצאי דופן רבים של ארגון חומצות הגרעין. מאז 1953, מאמינים שכל ה-DNA הוא מולקולות ליניאריות דו-גדיליות, בעוד שה-RNA הוא חד-גדילי בלבד. עמדה זו התערערה משמעותית בשנת 1961, כאשר ר' סינהיימר גילה שה-DNA של הפאג φ X 174 מיוצג על ידי מולקולה מעגלית חד-גדילית. עם זאת, מאוחר יותר התברר שבצורה זו ה-DNA הזה קיים רק בחלקיק פאג' וגטטיבי, וגם הצורה המשכפלת של ה-DNA של הפאג הזה היא דו-גדילית. בנוסף, התברר שזה די בלתי צפוי שה-RNA של כמה וירוסים יכול להיות דו-גדילי. סוג חדש זה של ארגון מקרו-מולקולרי של RNA התגלה בשנת 1962 על ידי P. Gomatos, I. Tamm וחוקרים אחרים בכמה וירוסים של בעלי חיים ובנגיף גידול פצעי צמחים. לאחרונה, V. I. Agol ו-A. A. Bogdanov (1970) קבעו כי בנוסף למולקולות RNA ליניאריות, קיימות גם מולקולות סגורות או מחזוריות. הם גילו RNA דו-גדילי מחזורי, במיוחד, בנגיף האנצפלומיאלוקרדיטיס. הודות לעבודותיהם של X. Deveaux, L. Tinoko, T. I. Tikhonenko, E. I. Budovsky ואחרים (1960 - 1974), נודעו המאפיינים העיקריים של ארגון (הנחת) החומר הגנטי בבקטריופאג'ים.

בסוף שנות ה-50 מצא המדען האמריקאי פ' דוטי שחימום גורם לדנטורציה של DNA, המלווה בשבירת קשרי מימן בין זוגות בסיסים ובהפרדה של שרשראות משלימות. לתהליך זה יש אופי של מעבר פאזה "ספירלה-סליל" ודומה להתכה של גבישים. לכן, דוטי כינה את תהליך הדנטורציה התרמית של המסת DNA DNA. עם קירור איטי, מתרחשת חידוש של מולקולות, כלומר, איחוד מחדש של חצאים משלימים.

עקרון ה-renaturation בשנת 1960 שימש את J. Marmur ו-K. Schildkraut כדי לקבוע את מידת ה"הכלאה" של DNA של מיקרואורגניזמים שונים. לאחר מכן, E. Bolton ו-B. McCarthy שיפרו טכניקה זו על ידי הצעת השיטה של ​​מה שנקרא עמודות DNA-אגר. שיטה זו התבררה כחיונית בחקר מידת ההומולוגיה של רצף הנוקלאוטידים של DNA שונה ובהבהרת הקשר הגנטי של אורגניזמים שונים. דנטורציה של DNA שהתגלתה על ידי דוטי בשילוב עם הכרומטוגרפיה על אלבומין מתיל שתואר על ידי J. Mandel and A. Hershey * (1960) וצנטריפוגה שיפוע צפיפות (השיטה פותחה בשנת 1957 על ידי M. Meselson, F. Stahl and D. וינוגרד) נמצא בשימוש נרחב להפרדה, בידוד וניתוח של גדילי DNA משלימים בודדים. לדוגמה, W. Shibalsky (ארה"ב), באמצעות טכניקות אלו להפרדת ה-DNA של הפאג למבדה, הראה בשנים 1967 - 1969 ששתי שרשראות הפאג' פעילות גנטית , ולא אחד, כפי שזה נחשב (S. Spiegelman, 1961). יש לציין שלראשונה הרעיון של המשמעות הגנטית של שני גדילי ה-DNA של הפאג למבדה הובע בברית המועצות על ידי SE Bresler (1961).

* (על עבודתם על הגנטיקה של חיידקים ווירוסים, א. הרשי, יחד עם מ. דלבריק וס. לוריא, זכו בפרס נובל ב-1969.)

כדי להבין את הארגון והפעילות התפקודית של הגנום, יש חשיבות עליונה לקביעת רצף הנוקלאוטידים של ה-DNA. החיפוש אחר שיטות לקביעה כזו מתבצע במעבדות רבות ברחבי העולם. מאז סוף שנות ה-50, M. Beer ומשתפי הפעולה שלו ניסו לבסס את רצף ה-DNA באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים בארה"ב, אך עד כה ללא הצלחה. בתחילת שנות ה-50, מהעבודות הראשונות של Sinsheimer, Chargaff וחוקרים אחרים על הפירוק האנזימטי של DNA, נודע כי נוקלאוטידים שונים במולקולת DNA מפוזרים, אם כי לא באופן אקראי, אבל באופן לא אחיד. לפי הכימאי האנגלי C. Barton (1961), פירמידינים (יותר מ-70%) מרוכזים בעיקר בצורת הגושים המקבילים. A.L. Mazin ו-B.F. Vanyushin (1968 - 1969) קבעו כי ל-DNA שונים יש דרגות שונות של לכידות פירמידין וכי ב-DNA של אורגניזמים של בעלי חיים הוא גדל באופן ניכר ככל שהוא נע מנמוך לגבוה יותר. לפיכך, התפתחות האורגניזמים באה לידי ביטוי גם במבנה הגנום שלהם. לכן, להבנת התהליך האבולוציוני בכללותו, יש חשיבות מיוחדת למחקר ההשוואתי של מבנה חומצות הגרעין. ניתוח המבנה של פולימרים בעלי חשיבות ביולוגית, וקודם כל, ה-DNA חשוב ביותר לפתרון בעיות מסוימות רבות של פילוגנטיקה וטקסונומיה.

מעניין לציין שהפיזיולוג האנגלי E. Lankester, שחקר את ההמוגלובין של רכיכות, צפה את רעיונות הביולוגיה המולקולרית לפני 100 שנה בדיוק, כתב: "הבדלים כימיים בין מינים וזנים שונים של בעלי חיים וצמחים חשובים לא פחות לבירור ההיסטוריה של מקורם כצורתם. אילו יכולנו לבסס בבירור את ההבדלים בארגון המולקולרי ובתפקודם של אורגניזמים, נוכל להבין את מקורם והתפתחותם של אורגניזמים שונים הרבה יותר מאשר על בסיס תצפיות מורפולוגיות " * . המשמעות של מחקרים ביוכימיים לטקסונומיה הודגשה גם על ידי V. L. Komarov, שכתב כי "הבסיס של כל הדמויות המורפולוגיות גרידא, שעל בסיסן אנו מסווגים ומבססים מינים, הם בדיוק הבדלים ביוכימיים" **.

* (א.ר. לנקסטר. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- "Pfluger" s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

** (V. L. Komarov. יצירות נבחרות, כרך 1. מ.-ל., הוצאה לאור של האקדמיה למדעים של ברית המועצות, 1945, עמ' 331.)

A. V. Blagoveshchenskii ו-S. L. Ivanov, עוד בשנות העשרים של המאה ה-20, עשו את הצעדים הראשונים בארצנו כדי להבהיר שאלות מסוימות של האבולוציה והשיטתיות של אורגניזמים על בסיס ניתוח השוואתי של הרכבם הביוכימי (ראה פרק 2). ניתוח השוואתי של המבנה של חלבונים וחומצות גרעין הופך כעת לכלי מוחשי יותר ויותר עבור טקסונומים (ראה פרק 21). שיטה זו של ביולוגיה מולקולרית מאפשרת לא רק להבהיר את העמדה סוגים מסוימיםבמערכת, אבל גם מאלץ אותנו להסתכל מחדש על עצם עקרונות הסיווג של אורגניזמים, ולפעמים לשקול מחדש את המערכת כולה כמכלול, כפי שקרה, למשל, עם השיטתיות של מיקרואורגניזמים. אין ספק שבעתיד ניתוח מבנה הגנום יתפוס מקום מרכזי בכימוסיסטמטיקה של אורגניזמים.

חשיבות רבה להתפתחות הביולוגיה המולקולרית הייתה לפענוח מנגנוני שכפול ותעתוק ה-DNA (ראה פרק 24).

ביוסינתזה של חלבון

שינוי חשוב בפתרון בעיית הביוסינתזה של חלבונים קשור להתקדמות בחקר חומצות הגרעין. בשנת 1941, T. Kasperson (שוודיה) ובשנת 1942, J. Brachet (בלגיה) הפנו את תשומת הלב לעובדה שרקמות עם סינתזת חלבון פעילה מכילות כמות מוגברת של RNA. הם הגיעו למסקנה שלחומצות ריבונוקלאיות יש תפקיד מכריע בסינתזת חלבון. בשנת 1953, נראה כי E. Gale ו-D. Fox קיבלו עדויות ישירות למעורבות ישירה של RNA בביוסינתזה של חלבונים: על פי הנתונים שלהם, ריבונוקלאז דיכא באופן משמעותי את השילוב של חומצות אמינו בליזטים של תאים חיידקיים. נתונים דומים הושגו על ידי V. Olfri, M. Delhi ו-A. Mirsky (1953) על הומוגניות של כבד. מאוחר יותר, E. Gale דחה את הרעיון הנכון שלו לגבי התפקיד המוביל של RNA בסינתזת חלבונים, והאמין בטעות שהפעלת סינתזת חלבון במערכת נטולת תאים התרחשה בהשפעת חומר אחר בעל אופי לא ידוע. בשנת 1954, P. Zamechnik, D. Littlefield, R. B. Khesin-Lurie ואחרים מצאו כי השילוב הפעיל ביותר של חומצות אמינו מתרחש בשברים עשירים ב-RNA של חלקיקים תת-תאיים - מיקרוזומים. P. Zamechnik ו-E. Keller (1953 - 1954) מצאו שהשילוב של חומצות אמינו הוגבר באופן ניכר בנוכחות הסופרנטנט בתנאים של התחדשות ATP. P. Sikevitz (1952) ומ. Hoagland (1956) בודדו שבריר חלבון (שבריר pH 5) מהסופרנטנט, שהיה אחראי לגירוי חד של שילוב חומצות אמינו במיקרוזומים. יחד עם חלבונים, נמצאה בסופרנטנט מחלקה מיוחדת של RNAs במשקל מולקולרי נמוך, הנקראים כעת טרנספר RNAs (tRNAs). בשנת 1958, Hoagland ו-Zamechnik, כמו גם P. Berg, R. Sweet ו-F. Allen וחוקרים רבים אחרים מצאו שכל חומצת אמינו דורשת אנזים מיוחד משלה, ATP ו-tRNA ספציפי, כדי להפעיל. התברר ש-tRNAs מבצעים אך ורק את הפונקציה של מתאמים, כלומר מכשירים שמוצאים מקום על המטריצה ​​הגרעינית (mRNA) לחומצת האמינו המקבילה במולקולת החלבון המתהווה. מחקרים אלו אישרו באופן מלא את השערת המתאם של F. Crick (1957), אשר סיפקה את קיומם של מתאמי פולינוקלאוטידים בתא, הנחוצים לסידור נכון של שאריות חומצות אמינו של החלבון המסונתז על מטריצת הגרעין. הרבה יותר מאוחר, המדען הצרפתי F. Chapville (1962) במעבדתו של פ. ליפמן (פרס נובל, 1953) בארה"ב הראה בצורה גאונית וחד משמעית כי מיקומה של חומצת אמינו במולקולת חלבון מסונתזת נקבע לחלוטין על ידי tRNA ספציפי אליו הוא מחובר. השערת המתאם של קריק פותחה על ידי Hoagland ו-Zamechnik.

עד 1958, נודעו השלבים העיקריים הבאים של סינתזת חלבון: 1) הפעלה של חומצת אמינו על ידי אנזים ספציפי מ"שבר ה-pH 5" בנוכחות ATP עם היווצרות של aminoacyl adenylate; 2) התקשרות של חומצת אמינו מופעלת ל-tRNA ספציפי עם שחרור של אדנוזין מונופוספט (AMP); 3) קישור של aminoacyl-tRNA (tRNA טעון בחומצת אמינו) למיקרוזומים ושילוב חומצות אמינו לחלבון עם שחרור tRNA. Hoagland (1958) ציין שגואנוזין טריפוספט (GTP) נדרש בשלב האחרון של סינתזת חלבון.

העברת RNA וסינתזת גנים

לאחר גילוי ה-tRNA, החלו חיפושים פעילים לפירוקם וקביעת רצף הנוקלאוטידים. הביוכימאי האמריקאי ר' הולי השיג את ההצלחה הגדולה ביותר. בשנת 1965, הוא הקים את המבנה של אלנין tRNA משמרים. באמצעות ריבונוקלאזות (guanyl RNase ו- RNase pancreatic), הולי חילק את מולקולת חומצת הגרעין למספר מקטעים, קבע את רצף הנוקלאוטידים בכל אחד מהם בנפרד, ולאחר מכן שיחזר את הרצף של כל מולקולת ה-tRNA של אלנין. דרך זו של ניתוח רצף הנוקלאוטידים נקראת שיטת הבלוק. הכשרון של הולי היה בעיקר בעובדה שהוא למד לחלק את מולקולת ה-RNA לא רק לחתיכות קטנות, כפי שעשו רבים לפניו, אלא גם לשברים גדולים (רבעים וחצאים). זה נתן לו את ההזדמנות להרכיב כראוי חלקים קטנים בודדים יחד ובכך ליצור מחדש את רצף הנוקלאוטידים המלא של מולקולת ה-tRNA כולה (פרס נובל, 1968).

טכניקה זו אומצה מיד על ידי מעבדות רבות ברחבי העולם. במהלך השנתיים הבאות, המבנה הראשוני של מספר tRNAs פוענח בברית המועצות ומחוצה לה. A.A. Baev (1967) ועמיתיו ביססו את רצף הנוקלאוטידים ב-tRNA של שמרים ולין בפעם הראשונה. עד כה, יותר מתריסר tRNAs בודדים שונים נחקרו. שיא מוזר בקביעת רצף הנוקלאוטידים נקבע בקיימברידג' על ידי פ. סנגר וג'י בראונלי. חוקרים אלו פיתחו שיטה אלגנטית להפליא להפרדת אוליגונוקלאוטידים ולרישום רצף מה שנקרא 5 S (ריבוזומלי) RNA מתאי E. coli (1968). RNA זה מורכב מ-120 שיירי נוקלאוטידים, ובניגוד ל-tRNA, אינו מכיל בסיסים מינוריים נוספים, אשר מקלים מאוד על הניתוח של רצף הנוקלאוטידים, המשמשים כנקודות ציון ייחודיות למקטעים בודדים של המולקולה. נכון לעכשיו, הודות לשימוש בשיטה של ​​סנגר ובראונלי, העבודה על חקר הרצף של RNA ריבוזמלי ארוך וכמה RNA נגיפי מתקדמת בהצלחה במעבדתם של ג'יי איבל (צרפת) וחוקרים אחרים.

A. A. Baev ועמיתיו (1967) מצאו ש-tRNA של valine חתוך לשניים משחזר את המבנה המקרו-מולקולרי שלו בתמיסה, ולמרות פגם במבנה הראשוני, יש לו את הפעילות התפקודית של המולקולה המקורית (המקורית). גישה זו - שחזור של מקרומולקולה חתוכה לאחר הסרת שברים מסוימים - התבררה כמבטיחה מאוד. כיום הוא נמצא בשימוש נרחב כדי להבהיר את התפקיד התפקודי של מקטעים בודדים של tRNAs מסוימים.

בשנים האחרונות הושגה הצלחה רבה בהשגת תכשירים גבישיים של tRNA בודדים. tRNAs רבים כבר התגבשו במספר מעבדות בארה"ב ובאנגליה. זה איפשר לחקור את המבנה של tRNA באמצעות ניתוח דיפרקציה של קרני רנטגן. בשנת 1970, ר' בוק הציג את דפוסי הרנטגן הראשונים ומודלים תלת מימדיים של מספר tRNAs שיצר באוניברסיטת ויסקונסין. מודלים אלה עוזרים לקבוע את הלוקליזציה של אתרים פעילים פונקציונלית בודדים ב-tRNA ולהבין את העקרונות הבסיסיים של תפקוד מולקולות אלה.

לפענוח אופי הקוד הגנטי (ראה פרק 24), אשר, ללא הגזמה, ניתן להתייחס אליו כהישג המוביל של מדעי הטבע במאה ה-20, היה בעל חשיבות עליונה לחשיפת מנגנון סינתזת החלבון ולפתרון הבעיה. לגבי הספציפיות של תהליך זה.

גילויו של ר' הולי על המבנה הראשוני של tRNA נתן תנופה לעבודתו של G. Korana * (ארה"ב) על סינתזה של אוליגונוקלאוטידים וכיוונה אותם לסינתזה של מבנה ביולוגי ספציפי - מולקולת DNA המקודדת tRNA לאלנין. השלבים הראשונים בסינתזה הכימית של אוליגונוקלאוטידים קצרים שנעשו על ידי הקוראן לפני כמעט 15 שנים הגיעו לשיאם ב-1970 עם סינתזת הגנים הראשונה. קוראן ומשתפי הפעולה שלו עשו לראשונה סינתזה כימית של קטעים קצרים של 8-12 שיירי נוקלאוטידים מנוקלאוטידים בודדים. מקטעים אלה עם רצף נוקלאוטידים נתון יצרו באופן ספונטני חלקים משלימים דו-גדיליים עם חפיפה של 4-5 נוקלאוטידים. ואז החלקים המוכנים הללו חוברו מקצה לקצה בסדר הנכון באמצעות האנזים DNA ligase. כך, בניגוד לשכפול מולקולות ה-DNA, לפי א' קורנברג ** (ראה פרק 24), הקוראן הצליח ליצור מחדש מולקולת DNA דו-גדילית טבעית על פי תוכנית מתוכננת מראש בהתאם ל- רצף ה-tRNA שתואר על ידי הולי. באופן דומה, מתבצעת כעת עבודה על סינתזה של גנים אחרים (M. N. Kolosov, Z. A. Shabarova, D. G. Knorre, 1970 - 1975).

* (על חקר הקוד הגנטי, זכו ג' קוראן ומ' נירנברג בפרס נובל ב-1968.)

** (על גילוי סינתזת פולימראז ודנ"א א. קורנברג, ועל סינתזה של RNA ס. אוצ'ואה בשנת 1959 זכה בפרס נובל.)

מיקרוזומים, ריבוזומים, תרגום

באמצע שנות ה-50, האמינו שמיקרוזומים הם מרכז סינתזת החלבון בתא. המונח מיקרוזומים הוצג לראשונה בשנת 1949 על ידי א. קלוד כדי להתייחס לשבריר של גרגירים קטנים. מאוחר יותר התברר שלא כל החלק של המיקרוזומים, המורכב ממברנות וגרגירים, אלא רק חלקיקי ריבונוקלאופרוטאין קטנים, אחראי לסינתזת חלבון. חלקיקים אלו בשנת 1958 כונו ריבוזומים על ידי ר' רוברטס.

מחקרים קלאסיים של ריבוזומים חיידקיים בוצעו על ידי A. Tisier ו-J. Watson בשנים 1958-1959. ריבוזומים חיידקיים התבררו כקטנים במקצת מאלה של צמחים ובעלי חיים. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) ו- E. N. Svetailo (1966) הראו שהריבוזומים של הכלורופלסטים של צמחים גבוהים יותר ומיטוכונדריה שייכים לסוג החיידק. A. Tisier ואחרים (1958) מצאו שריבוזומים מתפרקים לשתי תת-יחידות לא שוות המכילות מולקולת RNA אחת כל אחת. בסוף שנות ה-50 האמינו שכל מולקולת RNA ריבוזומלית מורכבת מכמה שברים קצרים. עם זאת, AS Spirin בשנת 1960 היה הראשון שהראה ש-RNA בתת-חלקיקים מיוצג על ידי מולקולה רציפה. D. Waller (1960), לאחר שהפריד חלבונים ריבוזומליים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל עמילן, גילה שהם הטרוגניים מאוד. בתחילה, רבים פקפקו בנתונים של וולר, שכן נראה היה שחלבון הריבוזום צריך להיות הומוגני למהדרין, כמו, למשל, חלבון TMV. כיום, כתוצאה ממחקרם של ד' וולר, ר' טראוט, פ' טראוב וביוכימאים נוספים, נודע כי הרכב החלקיקים הריבוזומליים בפועל כולל יותר מ-50 חלבונים שונים לחלוטין במבנה. AS Spirin בשנת 1963 היה הראשון שגילה תת-חלקיקים ריבוזומליים והראה שריבוזומים הם גדיל ריבונוקלאופרוטאין מעוות בצורה קומפקטית, שיכול להתפתח בתנאים מסוימים. בשנים 1967 - 1968 M. Nomura שיחזר לחלוטין תת-יחידה פעילה ביולוגית מ-RNA וחלבון ריבוזומלי ואף השיג ריבוזומים שבהם חלבון ו-RNA שייכים למיקרואורגניזמים שונים.

תפקידו של RNA ריבוזומלי עדיין לא ברור. ההנחה היא שזו אותה מטריצה ​​ספציפית ייחודית שעליה, במהלך היווצרותו של חלקיק ריבוזומלי, כל אחד מהחלבונים הריבוזומליים הרבים מוצא מקום מוגדר בהחלט (AS Spirin, 1968).

A. Rich (1962) גילה אגרגטים של מספר ריבוזומים המחוברים ביניהם על ידי גדיל של mRNA. קומפלקסים אלו נקראו פוליזומים. גילוי הפוליזומים אפשר ל-Rich and Watson (1963) להציע שהסינתזה של שרשרת הפוליפפטיד מתרחשת על הריבוזום, שכביכול נע לאורך שרשרת ה-mRNA. כאשר הריבוזום נע לאורך שרשרת ה-mRNA, המידע נקרא בחלקיק ונוצרת שרשרת הפוליפפטיד החלבון, וריבוזומים חדשים מתחברים לסירוגין לקצה הקריאה המשוחרר של ה-mRNA. מנתוני ריץ' ו-ווטסון עלה כי המשמעות של פוליזומים בתא טמונה בייצור המוני של חלבון על ידי קריאה רצופה של המטריצה ​​על ידי מספר ריבוזומים בו-זמנית.

כתוצאה ממחקריהם של מ' נירנברג, ס' אוצ'ואה, פ' ליפמן, ג' קוראנה ואחרים בשנים 1963 - 1970. נודע כי יחד עם mRNA, ריבוזומים, ATP ו-aminoacyl-tRNA, מספר רב של גורמים שונים לוקחים חלק בתהליך התרגום, וניתן לחלק את תהליך התרגום עצמו באופן מותנה לשלושה שלבים - התחלה, תרגום עצמו וסיום.

התחלת תרגום פירושה סינתזה של הקשר הפפטיד הראשון בריבוזום המורכב - פולינוקלאוטיד תבנית - aminoacyl-tRNA. פעילות ייזום כזו אינה מוחזקת על ידי שום aminoacyl-tRNA, אלא על ידי formylmethionyl-tRNA. חומר זה בודד לראשונה בשנת 1964 על ידי F. Senger ו-K. Marker. S. Bretcher and K. Marker (1966) הראו שתפקוד ההתחלה של formylmethionyl-tRNA נובע מהזיקה המוגברת שלו למרכז הפפטידיל של הריבוזום. לתחילת התרגום, חלק מגורמי התחלת החלבון חשובים ביותר, אשר בודדו במעבדות של S. Ochoa, F. Gro ומרכזי מחקר אחרים. לאחר היווצרות הקשר הפפטיד הראשון בריבוזום, התרגום עצמו מתחיל, כלומר, הוספה רציפה של שייר aminoacyl לקצה C של הפוליפפטיד. פרטים רבים על תהליך התרגום נחקרו על ידי ק. מונרו וג'יי בישופ (אנגליה), I. Rykhlik ו-F. Shorm (צ'כוסלובקיה), פ. ליפמן, מ. ברטשר, ו. גילברט (ארה"ב) וחוקרים נוספים. בשנת 1968, A.S. Spirin הציע השערה מקורית כדי להסביר את המנגנון של הריבוזום. המנגנון המניע המבטיח את כל התנועות המרחביות של tRNA ו-mRNA במהלך התרגום הוא פתיחה וסגירה תקופתית של תת-חלקיקי ריבוזום. סיום התרגום מקודד במטריצה ​​הניתנת לקריאה עצמה, המכילה את קודוני הסיום. כפי שהראה S. Brenner (1965 - 1967), שלישיות UAA, UAG ו-UGA הם קודונים כאלה. M. Capecci (1967) זיהה גם גורמי הפסקת חלבון מיוחדים. AS Spirin ו-LP Gavrilova תיארו את מה שמכונה סינתזת חלבון "לא אנזימטית" בריבוזומים (1972 - 1975) ללא השתתפות של גורמי חלבון. תגלית זו חשובה להבנת המקור והאבולוציה של ביוסינתזה של חלבון.

ויסות פעילות גנים וחלבונים

לאחר בעיית הספציפיות של סינתזת החלבון, הבעיה של ויסות סינתזת החלבון, או, מה זה אותו דבר, ויסות פעילות הגנים, התבררה במקום הראשון בביולוגיה מולקולרית.

חוסר השוויון התפקודי של תאים והדחקה והפעלה של גנים הקשורים אליו משכו זה מכבר את תשומת לבם של גנטיקאים, אך עד לאחרונה המנגנון האמיתי לשליטה בפעילות הגנים נותר עלום.

הניסיונות הראשונים להסביר את הפעילות הרגולטורית של גנים היו קשורים לחקר חלבוני היסטון. אפילו בני הזוג סטדמן * בתחילת שנות ה-40 של המאה העשרים. הציע שהיסטונים הם שיכולים לשחק את התפקיד העיקרי בתופעה זו. לאחר מכן, הם השיגו את הנתונים הברורים הראשונים על ההבדלים בטבע הכימי של חלבוני היסטון. כיום, מספר העובדות המעידות בעד השערה זו גדל מדי שנה.

* (א' סטדמן, א' סטדמן. החלבונים הבסיסיים של גרעיני התא.- פילוסוף. עָבָר. רועי. soc. לונדון, 1951, v. 235, 565 - 595.)

במקביל, כמות הולכת וגדלה של נתונים מצטברת, המעידה על כך שוויסות פעילות הגנים הוא תהליך מורכב הרבה יותר מהאינטראקציה הפשוטה של ​​קטעי גנים עם מולקולות חלבון היסטון. בשנים 1960 - 1962 במעבדתו של ר.ב.חסין-לוריא, נמצא כי גני הפאג מתחילים להיקרא ללא בו-זמנית: ניתן לחלק את גני הפאג T2 למוקדמים שתפקודם התרחש בדקות הראשונות להדבקה של חיידק. תאים, ומאוחרים, שהחלו לסנתז mRNA לאחר השלמת עבודתם של גנים מוקדמים.

ב-1961 הציעו הביוכימאים הצרפתים פ' ג'ייקוב וג'יי מונוד תכנית לוויסות פעילות הגנים, שמילאה תפקיד יוצא דופן בהבנת מנגנוני הוויסות של התא באופן כללי. על פי הסכמה של ג'ייקוב ומונוד, בנוסף לגנים מבניים (אינפורמטיביים), ה-DNA מכיל גם גנים-ווסת וגנים-מפעילים. הגן הרגולטור מקודד לסינתזה של חומר ספציפי - מדכא, שיכול להיצמד גם לגורם המשרה וגם לגן המפעיל. גן המפעיל מקושר לגנים מבניים, בעוד הגן הרגולטור ממוקם במרחק מה מהם. אם אין גורם מעורר בסביבה, למשל, לקטוז, הרי שהמדכא המסונתז על ידי הגן הרגולטור נקשר לגן המפעיל ובחסימתו, מכבה את העבודה של האופרון כולו (גוש של גנים מבניים יחד עם המפעיל ששולט בהם). יצירת אנזים אינה מתרחשת בתנאים אלה. אם מופיע משרן (לקטוז) בתווך, אזי התוצר של הגן הרגולטור, המדכא, נקשר ללקטוז ומסיר את החסימה מגן המפעיל. במקרה זה, העבודה של הגן המבני המקודד לסינתזה של האנזים מתאפשרת, והאנזים (לקטוז) מופיע בתווך.

לפי ג'ייקוב ומונוד, תכנית ויסות זו חלה על כל האנזימים האדפטיביים ויכולה להתרחש הן במהלך הדחקה, כאשר היווצרות האנזים מדוכאת על ידי עודף של תוצר התגובה, והן במהלך האינדוקציה, כאשר החדרת סובסטרט גורמת הסינתזה של האנזים. על מחקרים על ויסות פעילות הגנים, זכו יעקב ומונוד בפרס נובל ב-1965.

בתחילה, תוכנית זו נראתה מופרכת מדי. אולם מאוחר יותר התברר שוויסות הגנים על פי עיקרון זה מתרחש לא רק בחיידקים, אלא גם באורגניזמים אחרים.

מאז 1960, מקום נכבד בביולוגיה מולקולרית תופס על ידי מחקרים על ארגון הגנום ומבנה הכרומטין באורגניזמים איקריוטיים (J. Bonner, R. Britten, W. Olfrey, P. Walker, Yu. S. Chhentsov , I. B. Zbarsky and others .) ותקנת תמלול (א. מירסקי, ג.פ. גאורגייב, מ. ברנסטיאל, ד. גול, ר. צנייב, ר. י. סלגניק). במשך זמן רב, טיבו של המדכא נותר עלום ושנוי במחלוקת. בשנת 1968, M. Ptashne (ארה"ב) הראה שחלבון הוא מדכא. הוא בודד אותו במעבדה של ג'יי ווטסון וגילה שלמדכא אכן יש זיקה למשרה (לקטוז) ובמקביל "מזהה" את גן המפעיל של ה-lac operon ונקשר אליו ספציפית.

ב-5 - 7 השנים האחרונות התקבלו נתונים על נוכחות של תא בקרה נוסף של פעילות גנים - הפרומוטור. הסתבר שבשכונת אתר המפעיל, אליו מחובר המוצר המסונתז על הרגולטור הגנים - חומר החלבון של המדכא, ישנו אתר נוסף, שגם אותו יש לייחס לחברי מערכת הרגולציה. של פעילות גנים. מולקולת חלבון של האנזים RNA פולימראז מחוברת לאתר זה. באזור הפרומוטור חייבת להתרחש הכרה הדדית של רצף הנוקלאוטידים הייחודי ב-DNA ובתצורה הספציפית של חלבון ה-RNA פולימראז. יישום תהליך קריאת מידע גנטי עם רצף נתון של גנים של האופרון הסמוך לפרומוטור יהיה תלוי ביעילות הזיהוי.

בנוסף לתכנית שתוארה על ידי ג'ייקוב ומונוד, ישנם מנגנונים נוספים של ויסות גנים בתא. F. Jacob and S. Brenner (1963) קבעו שוויסות שכפול ה-DNA החיידקי נשלט בצורה מסוימת על ידי קרום התא. הניסויים של ג'ייקוב (1954) באינדוקציה של פרופאגים שונים הראו באופן משכנע כי בהשפעת גורמים מוטגנים שונים בתא של חיידקים ליזוגניים, מתחילה שכפול סלקטיבי של גן הפרופאג', ושכפול הגנום המארח נחסם. בשנת 1970 דיווח פ. בל שמולקולות DNA קטנות יכולות לעבור מהגרעין לציטופלזמה ולהתעתוק שם.

לפיכך, ניתן לווסת את פעילות הגנים ברמת שכפול, שעתוק ותרגום.

חלה התקדמות משמעותית בחקר הרגולציה של לא רק סינתזה של אנזימים, אלא גם פעילותם. א' נוביק ול' סילארד הצביעו על תופעות של ויסות פעילות האנזימים בתא עוד בשנות החמישים. G. Umbarger (1956) מצא כי בתא יש דרך רציונלית מאוד לדכא את פעילות האנזים על ידי התוצר הסופי של שרשרת התגובות המשוב. כפי שקבעו J. Monod, J. Change, F. Jacob, A. Purdy וחוקרים נוספים (1956 - 1960), ויסות פעילות האנזים יכול להתבצע על פי העיקרון האלוסטרי. לאנזים או לאחת מתת-היחידות שלו, בנוסף לזיקה למצע, יש זיקה לאחד ממוצרי שרשרת התגובה. בהשפעת תוצר אות כזה, האנזים משנה את מבנהו בצורה כזו שהוא מאבד פעילות. כתוצאה מכך, כל שרשרת התגובות האנזימטיות כבויה כבר בהתחלה. ד' ווימן ור' וודוורד (1952; חתן פרס נובל, 1965) הצביעו על התפקיד המהותי של שינויים קונפורמציוניים של חלבון בתגובות אנזימטיות, ובמובן מסוים, נוכחות של אפקט אלוסטרי.

מבנה ותפקוד של חלבונים

כתוצאה מעבודתם של ט' אוסבורן, ג' הופמייסטר, א' גורבר, פ' שולץ ורבים אחרים בסוף המאה ה-19. חלבונים רבים מן החי והצומח התקבלו בצורה גבישית. בערך באותו זמן, המשקלים המולקולריים של חלבונים מסוימים נקבעו בשיטות פיזיקליות שונות. אז, בשנת 1891, A. Sabaneev ו- N. Alexandrov דיווחו שהמשקל המולקולרי של אולבומין הוא 14,000; בשנת 1905, E. ריד מצא כי המשקל המולקולרי של המוגלובין הוא 48,000. המבנה הפולימרי של חלבונים התגלה בשנת 1871 על ידי G. Glasivetz וד. Gaberman. הרעיון של קשר פפטיד של שאריות חומצות אמינו בודדות בחלבונים הועלה על ידי T. Curtius (1883). עבודה על עיבוי כימי של חומצות אמינו (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano and D. Traschiatti, 1900) וסינתזה של הטרופוליפפטידים (E. Fisher, 1902 - 1907, פרס נובל, 1902) הוביל לפיתוח העקרונות הבסיסיים המבנה הכימי של חלבונים.

האנזים הגבישי הראשון (אוראז) הושג בשנת 1926 על ידי ג'יי סאמנר (פרס נובל, 1946), ובשנת 1930 השיג ג'יי נורת'רופ (פרס נובל, 1946) פפסין גבישי. לאחר עבודות אלו, התברר כי אנזימים הם בעלי אופי חלבוני. בשנת 1940, M. Kunits בודד RNase גבישי. ב-1958 כבר היו ידועים יותר מ-100 אנזימים גבישיים ויותר מ-500 אנזימים לא גבישיים. השגת תכשירים מטוהרים מאוד של חלבונים בודדים תרמה לפענוח המבנה הראשוני והארגון המקרו-מולקולרי שלהם.

חשיבות רבה לפיתוח הביולוגיה המולקולרית בכלל והגנטיקה האנושית, בפרט, הייתה גילויו של ל' פאולינג (1940) של המוגלובין S חריג, שבודד מאריתרוציטים של אנשים עם מחלה תורשתית קשה, אנמיה חרמשית. בשנים 1955 - 1957 W. Ingram השתמש בשיטת "טביעת האצבע" שפותחה על ידי F. Sanger (כתמים שנוצרו על ידי פפטידים בודדים במהלך כרומטוגרפיה על נייר) כדי לנתח את תוצרי ההידרוליזה של המוגלובין S עם אלקלי וטריפסין. בשנת 1961 דיווח אינגרם כי המוגלובין S שונה מהמוגלובין רגיל רק בטבעו של שארית חומצת אמינו אחת: בהמוגלובין תקין, שארית חומצה גלוטמית נמצאת במיקום השביעי של השרשרת, ובהמוגלובין S, שארית ולין. לפיכך, הנחתו של פאולינג (1949) כי אנמיה חרמשית היא מחלה בעלת אופי מולקולרי אוששה במלואה. שינוי תורשתי בשארית חומצת אמינו אחת בלבד בכל מחצית ממקרומולקולת ההמוגלובין מוביל לכך שההמוגלובין מאבד את יכולתו להתמוסס בקלות בריכוז חמצן נמוך ומתחיל להתגבש, מה שמוביל לשיבוש מבנה התא. מחקרים אלו הראו בבירור כי המבנה של חלבון הוא רצף חומצות אמינו מוגדר בקפדנות המקודד בגנום. עבודותיו של K. Anfinsen (1951) העידו על החשיבות יוצאת הדופן של המבנה הראשוני של חלבון ביצירת מבנה ייחודי פעיל ביולוגית של מקרומולקולה. אנפינסן הראה שהמאקרו-מבנה הפעיל ביולוגית של ריבונוקלאז הלבלב, שאבד כתוצאה משיקום, נקבע מראש על ידי רצף חומצות האמינו ויכול להופיע מחדש באופן ספונטני במהלך החמצון של קבוצות SH של שאריות ציסטאין עם היווצרות של קישורי דיסולפיד באופן קפדני. מקומות מוגדרים של שרשרת הפפטידים של האנזים.

עד כה, מנגנון הפעולה של מספר רב של אנזימים נחקר בפירוט ונקבע מבנה של חלבונים רבים.

בשנת 1953, F. Sanger קבע את רצף חומצות האמינו של אינסולין. : חלבון זה מורכב משתי שרשראות פוליפפטידיות המחוברות על ידי שני קישורי דיסולפיד. אחת מהשרשרות מכילה רק 21 שאריות חומצות אמינו, בעוד שהשנייה מכילה 30 שאריות. סנגר בילה כ-10 שנים בפענוח המבנה של החלבון הפשוט יחסית הזה. בשנת 1958 הוענק לו פרס נובל על מחקר יוצא דופן זה. לאחר יצירתו על ידי V. Stein and S. Moore (1957) של מנתח אוטומטי של חומצות אמינו, זיהוי תוצרים של הידרוליזה חלקית של חלבונים הואץ באופן משמעותי. ב-1960, שטיין ומור כבר דיווחו על כך. שהם הצליחו לקבוע את רצף הריבונוקלאז, ששרשרת הפפטידים שלו מיוצגת על ידי 124 שיירי חומצות אמינו. באותה שנה, במעבדתו של G. Schramm בטובינגן (גרמניה), F. Anderer ואחרים קבעו את רצף חומצות האמינו בחלבון TMV. לאחר מכן נקבע רצף חומצות האמינו במיוגלובין (A. Edmunson) ובשרשראות α ו-β של המוגלובין אנושי (G. Braunitzer, E. Schroeder וכו'), ליזוזים מחלבון ביצה (J. Jollet, D. Keyfield) . בשנת 1963, F. Shorm ו-B. Keil (צ'כוסלובקיה) ביססו את רצף חומצות האמינו במולקולת הכימוטריפסינוגן. באותה שנה נקבע רצף חומצות האמינו של טריפסינוגן (F. Shorm, D. Walsh). בשנת 1965, K. Takahashi הקים את המבנה העיקרי של ribonuclease T1. לאחר מכן נקבע רצף חומצות האמינו עבור מספר חלבונים נוספים.

כידוע, ההוכחה הסופית לנכונות ההגדרה של מבנה מסוים היא הסינתזה שלו. בשנת 1969, R. Merifield (ארה"ב) היה הראשון שביצע את הסינתזה הכימית של ריבונוקלאז בלבלב. בשיטת הסינתזה שפיתח על נשא פאזה מוצקה, הוסיף מריפילד חומצת אמינו אחת אחרי השנייה לשרשרת בהתאם לרצף שתואר על ידי שטיין ומור. כתוצאה מכך הוא קיבל חלבון שהיה זהה באיכותו לריבונוקלאז הלבלב A. על גילוי המבנה של ריבונוקלאז, זכו V. Stein, S. Moore ו-K. Anfinsen בפרס נובל ב-1972. סינתזת חלבון טבעית זו פותחת סיכויים אדירים, ומצביעה על האפשרות ליצור חלבונים כלשהם בהתאם לרצף שתוכנן מראש.

ממחקרי רנטגן של W. Astbury (1933) עלה כי שרשראות הפפטידים של מולקולות החלבון מעוותות או מוערמות בצורה מוגדרת בהחלט. מאז אותה תקופה, מחברים רבים הביעו השערות שונות לגבי דרכי קיפול שרשראות חלבון, אך עד 1951, כל המודלים נותרו מבנים ספקולטיביים שלא התאימו לנתונים ניסיוניים. ב-1951 פרסמו ל' פאולינג ור' קורי סדרה של יצירות מבריקות שבהן גובשה לבסוף התיאוריה של המבנה המשני של חלבונים, התיאוריה של α-helix. יחד עם זה, נודע גם שלחלבונים יש מבנה שלישוני: ניתן לקפל את ה-α-helix של שרשרת הפפטידים בצורה מסוימת, וליצור מבנה קומפקטי למדי.

בשנת 1957, ג'יי קנדרו ומשתפי הפעולה שלו הציעו לראשונה דגם תלת מימדמבני מיוגלובין. מודל זה שוכלל לאחר מכן במשך מספר שנים, עד שהעבודה הסופית הופיעה ב-1961 עם אפיון המבנה המרחבי של חלבון זה. בשנת 1959 ביססו מ' פרוץ ועמיתיו את המבנה התלת מימדי של המוגלובין. חוקרים השקיעו יותר מ-20 שנה בעבודה זו (צילומי הרנטגן הראשונים של המוגלובין הושגו על ידי פרוץ ב-1937). מכיוון שמולקולת ההמוגלובין מורכבת מארבע יחידות משנה, לאחר שפענחה את הארגון שלה, פרוץ תיאר בכך לראשונה את המבנה הרבעוני של החלבון. על עבודתם על קביעת המבנה התלת מימדי של חלבונים, קנדרו ופרוט זכו בפרס נובל ב-1962.

יצירת מודל מרחבי של מבנה ההמוגלובין על ידי Perutz ALLOWED. להתקרב להבנת מנגנון התפקוד של חלבון זה, אשר, כידוע, מבצע הובלת חמצן בתאי בעלי חיים. עוד בשנת 1937, פ. גאורוביץ הגיע למסקנה שהאינטראקציה של המוגלובין עם חמצן, אוויר צריכה להיות מלווה בשינוי במבנה החלבון. בשנות ה-60 גילו פרוץ ועמיתיו לעבודה שינוי ניכר בשרשרות ההמוגלובין לאחר חמצונו, שנגרם כתוצאה מהסטת אטומי ברזל כתוצאה מקשירה לחמצן. על בסיס זה נוצרו רעיונות לגבי "נשימה" של מקרומולקולות חלבון.

בשנת 1960 החלו ד.פיליפס ושותפיו במחקרי עקיפה בקרני רנטגן של מולקולת הליזוזים. עד 1967, הם הצליחו פחות או יותר לקבוע את פרטי הארגון של חלבון זה ואת הלוקליזציה של אטומים בודדים במולקולה שלו. בנוסף, פיליפס גילה את אופי התוספת של ליזוזים למצע (טריאצטיל גלוקוזאמין). זה איפשר ליצור מחדש את המנגנון של אנזים זה. לפיכך, הידע על המבנה הראשוני והארגון המקרו-מולקולרי אפשרו לא רק לבסס את אופי המרכזים הפעילים של אנזימים רבים, אלא גם לחשוף במלואו את מנגנון התפקוד של מקרומולקולות אלו.

השימוש בשיטות מיקרוסקופיה אלקטרונים עזר לחשוף את עקרונות הארגון המקרו-מולקולרי של תצורות חלבון מורכבות כמו קולגן, פיברינוגן, ספירלי שרירים מתכווצים וכו'. בסוף שנות החמישים הוצעו מודלים של מנגנון התכווצות השרירים. חשיבות יוצאת דופן להבנת מנגנון התכווצות השרירים הייתה הגילוי של V.A. Engelgardt ו-M.N. Lyubimova (1939) של פעילות ATPase של מיוזין. משמעות הדבר היא שפעולת התכווצות השרירים מבוססת על שינוי בתכונות הפיזיקוכימיות ובארגון המקרו-מולקולרי של החלבון המתכווץ בהשפעת חומצה טריפוספורית אדנוזין (ראה גם פרק 11).

מחקר וירולוגי היה חיוני להבנת העקרונות של הרכבת מבנים ביולוגיים (ראה פרק 25).

נושאים לא פתורים

ההתקדמות העיקרית בביולוגיה מולקולרית מודרנית הושגה בעיקר כתוצאה מחקר חומצות גרעין. עם זאת, גם בתחום הזה רחוק מלהיות כל הבעיות נפתרו. יידרשו מאמצים גדולים במיוחד כדי לפענח את כל רצף הנוקלאוטידים של הגנום. בעיה זו, בתורה, קשורה קשר בל יינתק עם בעיית ההטרוגניות של ה-DNA ודורשת פיתוח שיטות מתקדמות חדשות לפירוק ובידוד של מולקולות בודדות מכלל החומר הגנטי של התא.

עד כה, המאמצים התמקדו בעיקר במחקר נפרד של חלבונים וחומצות גרעין. בתא, ביו-פולימרים אלו קשורים זה לזה באופן בלתי נפרד ומתפקדים בעיקר בצורה של נוקלאופרוטאין. לכן, הצורך לחקור את האינטראקציה בין חלבונים וחומצות גרעין הפך כעת לחריף במיוחד. בעיית ההכרה של חלקים מסוימים של חומצות גרעין על ידי חלבונים מובאת לידי ביטוי. כבר הוגדרו שלבים לקראת חקר אינטראקציה כזו של ביו-פולימרים אלו, שבלעדיו לא ניתן להעלות על הדעת הבנה מלאה של המבנה והתפקודים של כרומוזומים, ריבוזומים ומבנים אחרים. בלי זה, אי אפשר גם להבין את ויסות פעילות הגנים ולפענח לבסוף את עקרונות עבודתם של מנגנוני סינתזה של חלבונים. לאחר עבודתם של יעקב ומונוד, הופיעו כמה נתונים חדשים על המשמעות הרגולטורית של ממברנות בסינתזה של חומר גרעיני. זה מציב את הבעיה של מחקר מעמיק יותר של תפקידם של ממברנות בוויסות שכפול ה-DNA. באופן כללי, בעיית הוויסות של פעילות הגנים ופעילות התא בכלל הפכה לאחת הבעיות החשובות ביותר של הביולוגיה המולקולרית המודרנית.

המצב הנוכחי של הביופיזיקה

בקשר הדוק עם בעיות הביולוגיה המולקולרית, התפתחה התפתחות הביופיזיקה. ההתעניינות בתחום זה של הביולוגיה עוררה, מחד גיסא, על ידי הצורך במחקר מקיף של ההשפעות של סוגים שונים של קרינה על הגוף, ומאידך, על ידי הצורך ללמוד את הפיזיקה והפיזיקה. -יסודות כימיים של תופעות חיים המתרחשות ברמה המולקולרית.

קבלת מידע מדויק על מבנים מולקולריים ועל התהליכים המתרחשים בהם התאפשרה כתוצאה משימוש בשיטות פיסיקליות וכימיות עדינות חדשות. בהתבסס על הישגי האלקטרוכימיה, ניתן היה לשפר את שיטת מדידת הפוטנציאלים הביו-אלקטריים באמצעות אלקטרודות סלקטיביות ליונים (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60s). יותר ויותר, ספקטרוסקופיה אינפרא אדום (עם שימוש במכשירי לייזר) נכנסת לפועל, המאפשרת לחקור את השינויים הקונפורמטיביים בחלבונים (I. Plotnikov, 1940). מידע רב ערך מסופק גם על ידי השיטה של ​​תהודה פרמגנטית אלקטרונית (E. K. Zavoisky, 1944) ושיטת הביוכימילומינסנט (B. N. Tarusov et al., 1960), המאפשרות, בפרט, לשפוט את ההובלה של אלקטרונים במהלך תהליכי חמצון.

בשנות החמישים, הביופיזיקה כבר תפסה עמדה חזקה. יש צורך להכשיר מומחים מוסמכים. אם בשנת 1911 באירופה רק לאוניברסיטת פק בהונגריה היה קתדרה לביופיזיקה, הרי שבשנת 1973 קיימים כסאות כאלה כמעט בכל האוניברסיטאות הגדולות.

בשנת 1960 התארגנה האגודה הבינלאומית לביופיזיקאים. באוגוסט 1961 התקיים הקונגרס הביופיזי הבינלאומי הראשון בשטוקהולם. הקונגרס השני נערך ב-1965 בפריז, השלישי - ב-1969 בבוסטון, הרביעי - ב-1972 במוסקבה.

בביופיזיקה קיימת הבחנה ברורה בין שני תחומים בעלי תוכן שונה – ביופיזיקה מולקולרית וביופיזיקה תאית. הבחנה זו מקבלת גם ביטוי ארגוני: נוצרות מחלקות נפרדות של שני תחומי הביופיזיקה הללו. באוניברסיטת מוסקבה, המחלקה הראשונה לביופיזיקה נוצרה ב-1953 בפקולטה לביולוגיה ומדעי הקרקע, וקצת מאוחר יותר הופיעה המחלקה לביופיזיקה בפקולטה לפיזיקה. מחלקות אורגנו על אותו עיקרון באוניברסיטאות רבות אחרות.

ביופיסיקה מולקולרית

בשנים האחרונות, הקשר בין ביופיזיקה מולקולרית לביולוגיה מולקולרית התחזק יותר ויותר, וכיום קשה לעיתים לקבוע היכן עובר הגבול ביניהן. בהתקפה כללית על בעיית המידע התורשתי, שיתוף פעולה כזה בין ביופיזיקה וביולוגיה מולקולרית הוא בלתי נמנע.

הכיוון הראשי פנימה עבודת מחקרהוא חקר הפיזיקה של חומצות גרעין - DNA ו-RNA. השימוש בשיטות הנ"ל ומעל לכל ניתוח עקיפה של קרני רנטגן תרמו לפענוח מבנה מולקולריחומצות גרעין. נכון לעכשיו, מתנהל מחקר אינטנסיבי לחקר ההתנהגות של חומצות אלו בתמיסות. תשומת לב מיוחדת מוקדשת למעברים הקונפורמטיביים "סליל-סליל", הנלמדים על ידי שינויים בצמיגות, פרמטרים אופטיים וחשמליים. בקשר לחקר מנגנוני המוטגנזה מפותחים מחקרים לחקר השפעת הקרינה המייננת על התנהגות חומצות הגרעין בתמיסות וכן השפעת הקרינה על חומצות הגרעין של וירוסים ופאג'ים. ההשפעה של קרינה אולטרה סגולה, שחלק מהאזורים הספקטרליים שלה ידועים כנספגים היטב על ידי חומצות גרעין, נערכה לניתוח מקיף. חלק גדול במחקר מסוג זה הוא זיהוי רדיקלים פעילים של חומצות גרעין וחלבונים בשיטת תהודה פרמגנטית אלקטרונית. עם השימוש בשיטה זו, הופעתו של כיוון עצמאי שלם קשורה.

בעיית הקידוד של מידע DNA ו-RNA והעברה שלו במהלך סינתזת חלבונים מעניינת כבר זמן רב את הביופיזיקה המולקולרית, ופיזיקאים הביעו שוב ושוב שיקולים מסוימים בנושא זה (E. Schrödinger, G. Gamow). פענוח הקוד הגנטי גרם למחקרים תיאורטיים וניסיוניים רבים על מבנה סליל ה-DNA, מנגנון ההחלקה והפיתול של גדיליו, על המחקר כוח פיזימעורבים בתהליכים אלו.

ביופיזיקה מולקולרית מספקת סיוע ניכר לביולוגיה מולקולרית בחקר המבנה של מולקולות חלבון בעזרת ניתוח עקיפה של קרני רנטגן, אשר שימש לראשונה בשנת 1930 על ידי ג'יי ברנל. כתוצאה משימוש בשיטות פיזיקליות בשילוב עם ביוכימיות (שיטות אנזימטיות) התגלו הקונפורמציה המולקולרית ורצף חומצות האמינו במספר חלבונים.

מחקרים מיקרוסקופיים אלקטרוניים מודרניים, שחשפו את נוכחותן של מערכות ממברנות מורכבות בתאים ובאברוניהם, עוררו ניסיונות להבין את המבנה המולקולרי שלהם (ראה פרקים 10 ו-11). למד in vivo תרכובת כימיתממברנות ובמיוחד תכונות השומנים שלהם. נמצא שהאחרונים מסוגלים לחמצון יתר ולתגובות לא אנזימטיות של חמצון שרשרת (Yu. A. Vladimirov ו-F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov et al., 1960; I. I. Ivanov, 1967), מה שמוביל לתפקוד לקוי של הממברנה. כדי לחקור את הרכב הממברנות, החלו להשתמש גם בשיטות של מידול מתמטי (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).

ביופיזיקה תאית

אירוע משמעותי בתולדות הביופיזיקה היה היווצרותם בשנות החמישים של רעיונות ברורים לגבי התרמודינמיקה של תהליכים ביולוגיים, וכתוצאה מכך ההנחות לגבי האפשרות של יצירת אנרגיה עצמאית בתאים חיים, בניגוד לחוק השני של התרמודינמיקה. , לבסוף נעלם. הבנת פעולתו של חוק זה במערכות ביולוגיות קשורה בהקדמתו של המדען הבלגי I. Prigogine (1945) * לתרמודינמיקה ביולוגית של הרעיון של מערכות פתוחות המחליפות אנרגיה וחומר עם הסביבה החיצונית. Prigogine הראה כי אנטרופיה חיובית נוצרת בתאים חיים במהלך תהליכי עבודה בהתאם לחוק השני של התרמודינמיקה. המשוואות שהציג קבעו את התנאים שבהם נוצר המצב הנייח כביכול (בעבר הוא נקרא גם שיווי משקל דינמי), שבהם כמות האנרגיה החופשית (נגנטרופיה) הנכנסת לתאים עם מזון מפצה על צריכה שלה, והאנטרופיה החיובית היא תְפוּקָה. גילוי זה חיזק את הרעיון הביולוגי הכללי של הקשר הבלתי נפרד בין הסביבה החיצונית והפנימית של התאים. זה סימן את תחילתו של מחקר אמיתי של התרמודינמיקה של מערכות חיים, כולל שיטת המידול (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (התיאוריה הכללית של מערכות פתוחות הועלתה לראשונה על ידי L. Bertalanffy ב-1932.)

על פי העיקרון הבסיסי של ביו-תרמודינמיקה, תנאי הכרחי לקיומם של חיים הוא נייחות בפיתוח התהליכים הביוכימיים שלהם, שלצורך ביצועם יש צורך לתאם את שיעורי התגובות המטבוליות הרבות. על בסיס התרמודינמיקה הביו-פיזיקלית החדשה, נוצרה מגמה המייחדת גורמים חיצוניים ופנימיים המבטיחים תיאום תגובות זה והופכים אותו ליציב. במהלך שני העשורים האחרונים, התגלה תפקיד גדול בשמירה על המצב הנייח של מערכת המעכבים ובעיקר נוגדי החמצון (B. N. Tarusov and A. I. Zhuravlev, 1954, 1958). נקבע כי האמינות של פיתוח נייח קשורה לגורמים סביבתיים (טמפרטורה) ו תכונות פיזיקליות וכימיותסביבות תאים.

עקרונות מודרניים של ביותרמודינמיקה אפשרו לתת פרשנות פיזיקוכימית למנגנון ההסתגלות. על פי הנתונים שלנו, הסתגלות לתנאי הסביבה יכולה להתרחש רק אם, כאשר הם משתנים, האורגניזם מסוגל לבסס נייחות בפיתוח ביו תגובה כימית(B.N. Tarusov, 1974). עלתה השאלה של פיתוח שיטות חדשות שיאפשרו להעריך את המצב הנייח in vivo ולחזות את ההפרות האפשריות שלו. הכנסת עקרונות קיברנטיים של מערכות ויסות עצמיות לביו-תרמודינמיקה ומחקר על תהליכי ההסתגלות הביולוגית מבטיחה תועלת רבה. התברר שכדי לפתור את בעיית היציבות של המצב הנייח, חשוב לקחת בחשבון את מה שנקרא גורמים מטרידים, הכוללים, במיוחד, תגובות לא אנזימטיות של חמצון שומנים. לאחרונה מתרחבים מחקרים על תהליכי חמצון יתר בשלבי השומנים של תאים חיים וצמיחת מוצרים רדיקליים פעילים המפרים את הפונקציות הרגולטוריות של הממברנות. מקור המידע על תהליכים אלה הוא גם זיהוי של רדיקלי חמצן פעילים וגם תרכובות פרוקסיד של ביוליפידים (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 ואחרים). כדי לזהות רדיקלים, נעשה שימוש בביוכימילומינסנציה, המתרחשת בשומנים של תאים חיים במהלך הרקומבינציה שלהם.

על בסיס רעיונות פיזיקוכימיים לגבי יציבות המצב הנייח, עלו רעיונות ביו-פיזיקליים לגבי הסתגלותם של צמחים לשינויים בתנאי הסביבה כהפרה של מערכות נוגדי חמצון מעכבות (B.N. Tarusov, Ya. E. Doskoch, B. M. Kitlaev, A. M. Agaverdiev, 1968 - 1972). זה פתח את האפשרות להעריך תכונות כמו עמידות לכפור ועמידות למלח, כמו גם ביצוע תחזיות מתאימות בבחירת צמחים חקלאיים.

בשנות החמישים התגלה זוהר חלש במיוחד - ביוכימילומינסנציה של מספר עצמים ביולוגיים בחלקים הנראים והאינפרא אדום של הספקטרום (B. N. Tarusov, A. I. Zhuravlev, A. I. Polivoda). הדבר התאפשר כתוצאה מפיתוח שיטות לרישום שטפי אור חלשים במיוחד באמצעות מכפילי פוטו (L. A. Kubetsky, 1934). בהיותה תוצאה של תגובות ביוכימיות המתרחשות בתא חי, ביוכימילומינסנציה מאפשרת לשפוט תהליכי חמצון חשובים בשרשרות העברת האלקטרונים בין אנזימים. הגילוי והמחקר של ביוכימילומינסנציה הם בעלי חשיבות תיאורטית ומעשית רבה. אז, B. N. Tarusov ו- Yu. B. Kudryashov מציינים את התפקיד הגדול של תוצרי החמצון של חומצות שומן בלתי רוויות במנגנון התרחשותם של מצבים פתולוגיים המתפתחים בהשפעת קרינה מייננת, בקרצינוגנזה והפרות אחרות של התפקודים הנורמליים. של התא.

בשנות ה-50, בקשר להתפתחות המהירה של הפיזיקה הגרעינית, הגיחה מהביופיזיקה הרדיוביולוגיה, החוקרת את ההשפעה הביולוגית של קרינה מייננת. השגת איזוטופים רדיואקטיביים מלאכותיים, יצירת נשק תרמו-גרעיני, כורים גרעיניים ופיתוח צורות אחרות של שימוש מעשי אנרגיה אטומיתהציבה במלוא חריפותה את הבעיה של הגנה על אורגניזמים מההשפעות המזיקות של קרינה מייננת, פיתוח יסודות תיאורטיים למניעה וטיפול במחלות קרינה. לשם כך, היה צורך קודם כל לגלות אילו מרכיבים של התא וקישורי חילוף החומרים הם הפגיעים ביותר.

מושא המחקר בביופיזיקה וברדיוביולוגיה היה בירור אופי התגובות הכימיות הראשוניות המתרחשות במצעים חיים בהשפעת אנרגיית הקרינה. כאן היה חשוב לא רק להבין את המנגנונים של תופעה זו, אלא גם להיות מסוגל להשפיע על תהליך החלפת האנרגיה הפיזית באנרגיה כימית, כדי להפחית את מקדם הפעולה ה"שימושית" שלה. העבודה בכיוון זה בוצעה על ידי לימודים של בית הספר של נ.נ. סמנוב (1933) בברית המועצות וד. Hinshelwood (1935) באנגליה.

מקום חשוב במחקר הרדיוביולוגי תפס חקר מידת העמידות לקרינה של אורגניזמים שונים. נמצא שעמידות מוגברת לקרינה (למשל במכרסמים מדבריים) נובעת מפעילות נוגדת חמצון גבוהה של שומנים בקרום התא (M. Chang et al., 1964; N. K. Ogryzov et al., 1969). התברר שלטוקופרולים, ויטמין K ותרכובות תיו יש תפקיד חשוב ביצירת תכונות נוגדות החמצון של מערכות אלו (II Ivanov et al., 1972). בשנים האחרונות משכו גם מחקרים על מנגנוני המוטגנזה תשומת לב רבה. לצורך כך נחקרת השפעת הקרינה המייננת על התנהגות חומצות גרעין וחלבונים במבחנה, כמו גם בנגיפים ופאג'ים (A. Gustafson, 1945 - 1950).

המאבק לעלייה נוספת ביעילות ההגנה הכימית, החיפוש אחר מעכבים יעילים יותר ועקרונות העיכוב נותרו המשימות העיקריות של הביופיזיקה בכיוון זה.

חלה התקדמות במחקר של מצבים נרגשים של ביופולימרים, שקובעים את הפעילות הכימית הגבוהה שלהם. המוצלח ביותר היה חקר מצבים נרגשים המתעוררים בשלב הראשוני של תהליכים פוטו-ביולוגיים - פוטוסינתזה וראייה.

לפיכך, נרשמה תרומה מוצקה להבנת ההפעלה העיקרית של המולקולות של מערכות פיגמנט צמחים. הוכחה החשיבות הרבה של העברה (הגירה) של האנרגיה של מצבים נרגשים ללא הפסדים מפיגמנטים מופעלים למצעים אחרים. תפקיד מרכזי בפיתוח רעיונות אלה שיחק על ידי העבודות התיאורטיות של A. N. Terenin (1947 ואילך). A. A. Krasnovsky (1949) גילה וחקר את התגובה של הפחתה פוטוכימית הפיכה של כלורופיל והאנלוגים שלו. כיום ישנה אמונה כללית שבעתיד הקרוב ניתן יהיה לשחזר פוטוסינתזה בתנאים מלאכותיים (ראה גם פרק 5).

ביופיזיקאים ממשיכים לעבוד על חשיפת אופי התכווצות השרירים והמנגנונים של עירור והולכה עצביים (ראה פרק 11). מחקר על מנגנוני המעבר ממצב נרגש למצב נורמלי הפך גם הוא לחשיבות עכשווית. המצב הנרגש נחשב כעת כתוצאה מתגובה אוטוקטליטית, ועיכוב נחשב כתוצאה מגיוס חד של פעילות נוגדת חמצון מעכבת כתוצאה מסידור מחדש מולקולרי בתרכובות כגון טוקופרול (I.I. Ivanov, O.R. Kols, 1966; O.R. קולס, 1970).

הבעיה הכללית החשובה ביותר של הביופיזיקה נותרה הידע על התכונות הפיזיקליות והכימיות האיכותיות של חומר חי. מאפיינים כגון היכולת של ביו-פולימרים חיים לקשור באופן סלקטיבי אשלגן או לקטב זרם חשמלי אינם יכולים להישמר אפילו עם הסרה זהירה ביותר מהגוף. לכן, הביופיזיקה התאית ממשיכה לפתח באופן אינטנסיבי קריטריונים ושיטות לחקר חומר חי לכל החיים.

למרות צעירי הביולוגיה המולקולרית, ההתקדמות שעשתה בתחום הזה היא באמת מדהימה. ליחסית טווח קצרטבעו של הגן ועקרונות היסוד של הארגון, הרבייה ותפקודו נקבעו. יתרה מכך, לא רק בוצעה רבייה חוץ גופית של גנים, אלא גם בפעם הראשונה הושלמה הסינתזה המלאה של הגן עצמו. הקוד הגנטי פוענח לחלוטין והבעיה הביולוגית החשובה ביותר של הספציפיות של ביוסינתזה של חלבון נפתרה. הדרכים והמנגנונים העיקריים של יצירת חלבון בתא זוהו ונחקרו. המבנה הראשוני של RNAs תחבורה רבים, מולקולות מתאם ספציפיות שמתרגמות את שפת תבניות הגרעין לשפת רצף חומצות האמינו של החלבון המסונתז, נקבע לחלוטין. רצף חומצות האמינו של חלבונים רבים פוענח במלואו והמבנה המרחבי של חלק מהם נקבע. זה איפשר להבהיר את העיקרון והפרטים של תפקוד מולקולות האנזים. בוצעה סינתזה כימית של אחד האנזימים, ריבונוקלאז. עקרונות היסוד של הארגון של חלקיקים תת-תאיים שונים, וירוסים ופאג'ים רבים הוקמו, ונפרמו הדרכים העיקריות לביוגנזה שלהם בתא. התגלו גישות להבנת דרכי ויסות פעילות הגנים והבהרת מנגנוני הוויסות של פעילות חיונית. כבר רשימה פשוטה של ​​תגליות אלה מצביעה על כך שהמחצית השנייה של המאה ה-20. היה מסומן על ידי התקדמות אדירה בביולוגיה, אשר נובעת בעיקר ממחקר מעמיק של המבנה והתפקודים של מקרומולקולות חשובות מבחינה ביולוגית - חומצות גרעין וחלבונים.

הישגים בביולוגיה מולקולרית נמצאים בשימוש בפועל כיום ומביאים לתוצאות מוחשיות ברפואה, בחקלאות ובכמה תעשיות. אין ספק שהחזרה של המדע הזה תגדל מדי יום. עם זאת, עדיין יש להתייחס לתוצאה העיקרית שבהשפעת ההצלחות של הביולוגיה המולקולרית, התחזק האמון בקיומן של אפשרויות בלתי מוגבלות בדרך לחשיפת סודות החיים הסודיים ביותר.

בעתיד, ככל הנראה, ייפתחו דרכים חדשות לחקר הצורה הביולוגית של תנועת החומר – הביולוגיה תעבור מהרמה המולקולרית לרמה האטומית. עם זאת, כעת כנראה אין חוקר אחד שיכול לחזות באופן ריאלי את התפתחות הביולוגיה המולקולרית אפילו ל-20 השנים הבאות.

חוברת קומיקס לתחרות "ביו/מול/טקסט": היום ביולוג מולקולריהמבחנה תדריך אותך בעולם המדע המדהים - ביולוגיה מולקולרית! נתחיל בטיול היסטורי לאורך שלבי התפתחותו, נתאר את התגליות והניסויים העיקריים מאז 1933. ונתאר בבירור גם את השיטות העיקריות של הביולוגיה המולקולרית, שאפשרו לתמרן גנים, לשנות ולבודד אותם. הופעתן של שיטות אלה שימשה דחף חזק לפיתוח הביולוגיה המולקולרית. ובואו נזכור גם את תפקידה של הביוטכנולוגיה וניגע באחד הנושאים הפופולריים בתחום זה – עריכת גנום באמצעות מערכות CRISPR/Cas.

הספונסר הכללי של התחרות והשותף למועמדות לסקולטק הוא .

נותנת החסות לתחרות היא חברת Diaem: הספקית הגדולה ביותר של ציוד, ריאגנטים וחומרים מתכלים למחקר וייצור ביולוגיים.

החברה נתנה חסות לפרס בחירת הקהל.

נותן החסות של "ספר" לתחרות - "אלפינה עיון"

1. הקדמה. מהות הביולוגיה המולקולרית

הוא לומד את היסודות של הפעילות החיונית של אורגניזמים ברמה של מקרומולקולות. מטרת הביולוגיה המולקולרית היא לבסס את תפקידן ומנגנוני התפקוד של מקרומולקולות אלו על בסיס ידע על המבנים והתכונות שלהן.

מבחינה היסטורית, ביולוגיה מולקולרית נוצרה במהלך פיתוח תחומי ביוכימיה החוקרים חומצות גרעין וחלבונים. בעוד ביוכימיה חוקרת את חילוף החומרים, ההרכב הכימי של תאים חיים, אורגניזמים והתהליכים הכימיים המתבצעים בהם, הביולוגיה המולקולרית מתמקדת בחקר מנגנוני ההעברה, הרבייה והאחסון של מידע גנטי.

ומושא המחקר של הביולוגיה המולקולרית הוא חומצות הגרעין עצמן - דאוקסיריבונוקלאית (DNA), ריבונוקלאית (RNA) - וחלבונים, כמו גם המתחמים המקרומולקולריים שלהן - כרומוזומים, ריבוזומים, מערכות מולטי-אנזימים המספקות את הביוסינתזה של חלבונים וחומצות גרעין. ביולוגיה מולקולרית גובלת גם במושאי המחקר וחופפת חלקית לגנטיקה מולקולרית, וירולוגיה, ביוכימיה ועוד מספר מדעי ביולוגיה קשורים.

2. טיול היסטורי בשלבי התפתחות הביולוגיה המולקולרית

כתחום נפרד של ביוכימיה, הביולוגיה המולקולרית החלה להתפתח בשנות ה-30 של המאה הקודמת. כבר אז היה צורך להבין את תופעת החיים ברמה המולקולרית כדי לחקור את תהליכי ההעברה והאחסון של מידע גנטי. בדיוק באותה תקופה, משימת הביולוגיה המולקולרית הוקמה בחקר התכונות, המבנה והאינטראקציה של חלבונים וחומצות גרעין.

המונח "ביולוגיה מולקולרית" שימש לראשונה ב 1933 שנה ויליאם אסטברי במהלך חקר חלבונים פיברילרים (קולגן, פיברין בדם, חלבוני שריר מתכווצים). אסטברי חקר את הקשר בין המבנה המולקולרי לבין המאפיינים הביולוגיים, הפיזיקליים של חלבונים אלה. בתחילת הופעת הביולוגיה המולקולרית, ה-RNA נחשב למרכיב רק של צמחים ופטריות, ו-DNA - רק של בעלי חיים. ובתוך 1935 גילוי ה-DNA של אפונה על ידי אנדריי בלוזרסקי הוביל לביסוס העובדה ש-DNA כלול בכל תא חי.

בְּ 1940 הישג אדיר היה ביסוסם של ג'ורג' בידל ואדוארד טאתם של קשר סיבתי בין גנים לחלבונים. השערת המדענים "גן אחד - אנזים אחד" היוותה את הבסיס לתפיסה שהמבנה הספציפי של חלבון מווסת על ידי גנים. מאמינים שמידע גנטי מקודד על ידי רצף מיוחד של נוקלאוטידים ב-DNA המווסת את המבנה הראשוני של חלבונים. מאוחר יותר הוכח כי לחלבונים רבים יש מבנה רבעוני. שרשראות פפטידים שונות לוקחות חלק ביצירת מבנים כאלה. בהתבסס על זה, ההוראה על הקשר בין גן לאנזים השתנתה במידת מה, ועכשיו זה נשמע כמו "גן אחד - פוליפפטיד אחד".

בְּ 1944 ב-1999 הביולוג האמריקאי אוסוולד אייברי ועמיתיו (קולין מקלאוד ומקלין מקארתי) הוכיחו שהחומר שגורם להתמרה של חיידקים הוא DNA, לא חלבונים. הניסוי שימש כהוכחה לתפקידו של ה-DNA בהעברת מידע תורשתי, תוך מחיקת ידע מיושן על אופי החלבון של גנים.

בתחילת שנות ה-50, פרדריק סנגר הראה ששרשרת חלבון היא רצף ייחודי של שאריות חומצות אמינו. בְּ 1951 ו 1952 שנים, המדען קבע את הרצף המלא של שתי שרשראות פוליפפטידים - אינסולין בקר בְּ(30 שאריות חומצות אמינו) ו אבל(21 שיירי חומצות אמינו), בהתאמה.

בערך באותו זמן, ב 1951–1953 ארווין צ'רגאף ניסח את הכללים ליחס הבסיסים החנקניים ב-DNA. על פי הכלל, ללא קשר להבדלי המינים של אורגניזמים חיים ב-DNA שלהם, כמות האדנין (A) שווה לכמות הטימין (T), וכמות הגואנין (G) שווה לכמות הציטוזין (ג).

בְּ 1953 הוכיח את התפקיד הגנטי של ה-DNA. ג'יימס ווטסון ופרנסיס קריק, בהתבסס על צילום הרנטגן של ה-DNA שהושגו על ידי רוזלינד פרנקלין ומוריס ווילקינס, ביססו את המבנה המרחבי של ה-DNA והעלו הנחה מאושרת מאוחר יותר לגבי מנגנון השכפול שלו (הכפלה), העומד בבסיס התורשה.

1958 שנה - היווצרות הדוגמה המרכזית של הביולוגיה המולקולרית מאת פרנסיס קריק: העברת המידע הגנטי הולכת לכיוון של DNA → RNA → חלבון.

מהות הדוגמה היא שבתאים יש זרימה מכוונת מסוימת של מידע מה-DNA, שהוא, בתורו, הטקסט הגנטי המקורי, המורכב מארבע אותיות: A, T, G ו-C. הוא כתוב ב-DNA. סליל כפול ברצפי הצורה של האותיות הללו - נוקלאוטידים.

טקסט זה נמצא בתעתוק. והתהליך נקרא תַעֲתוּק. בתהליך זה מסונתז RNA, זהה לטקסט הגנטי, אך עם הבדל: ב-RNA, במקום T, יש U (uracil).

RNA זה נקרא RNA שליח (mRNA), או מַטרִיצָה (mRNA). מִשׁדָר mRNA מתבצע באמצעות הקוד הגנטי בצורה של רצפי טריפלט של נוקלאוטידים. במהלך תהליך זה, הטקסט של חומצות גרעין DNA ו-RNA מתורגם מטקסט בן ארבע אותיות לטקסט בן עשרים אותיות של חומצות אמינו.

יש רק עשרים חומצות אמינו טבעיות, ויש ארבע אותיות בטקסט של חומצות גרעין. בגלל זה, יש תרגום מהאלפבית בן ארבע האותיות לאלפבית בן עשרים האותיות דרך הקוד הגנטי, שבו כל שלושה נוקלאוטידים מקבילים לחומצת אמינו. אז אתה יכול ליצור שלמים 64 צירופים של שלוש אותיות מארבע אותיות, יתר על כן, יש 20 חומצות אמינו. מכאן נובע שהקוד הגנטי חייב בהכרח להיות בעל תכונה של ניוון. עם זאת, באותה תקופה הקוד הגנטי לא היה ידוע, חוץ מזה, הוא אפילו לא התחיל להתפענח, אבל קריק כבר ניסח את הדוגמה המרכזית שלו.

עם זאת, הייתה ודאות שהקוד חייב להתקיים. עד אז, הוכח שלקוד זה יש תו שלישייה. זה אומר שבאופן ספציפי שלוש אותיות בחומצות גרעין ( קודונים) מתאים לכל חומצת אמינו. ישנם 64 מהקודונים הללו, הם מקודדים ל-20 חומצות אמינו. המשמעות היא שכל חומצת אמינו מתאימה למספר קודונים בבת אחת.

לפיכך, אנו יכולים להסיק שהדוגמה המרכזית היא הנחה האומרת שזרימה מכוונת של מידע מתרחשת בתא: DNA → RNA → חלבון. קריק הדגיש את התוכן העיקרי של הדוגמה המרכזית: זרימה הפוכה של מידע לא יכולה להתרחש, חלבון אינו מסוגל לשנות מידע גנטי.

זוהי המשמעות העיקרית של הדוגמה המרכזית: חלבון אינו מסוגל לשנות ולהפוך מידע ל-DNA (או RNA), הזרימה תמיד הולכת רק בכיוון אחד.

זמן מה לאחר מכן, התגלה אנזים חדש, שלא היה ידוע בזמן ניסוח הדוגמה המרכזית, - תמלול הפוךשמסנתז DNA מ-RNA. האנזים התגלה בנגיפים, שבהם המידע הגנטי מקודד ב-RNA, לא ב-DNA. וירוסים כאלה נקראים רטרו-וירוסים. יש להם קפסולה ויראלית עם RNA סגור בתוכה ואנזים מיוחד. האנזים הוא transcriptase הפוכה המסנתז DNA לפי התבנית של ה-RNA הנגיפי הזה, וה-DNA הזה משמש אז כחומר הגנטי להמשך התפתחות הנגיף בתא.

כמובן, תגלית זו עוררה זעזוע גדול ומחלוקות רבות בקרב ביולוגים מולקולריים, שכן האמינו כי בהתבסס על דוגמה מרכזית, זה לא יכול להיות. עם זאת, קריק מיד הסביר שהוא מעולם לא אמר שזה בלתי אפשרי. הוא רק אמר שלעולם לא יכולה להיות זרימת מידע מחלבון לחומצות גרעין, וכבר בתוך חומצות גרעין כל סוג של תהליכים אפשריים בהחלט: סינתזה של DNA על DNA, DNA על RNA, RNA על DNA ו-RNA על RNA.

לאחר ניסוח הדוגמה המרכזית עדיין נותרו מספר שאלות: כיצד מקודד האלפבית של ארבעת הנוקלאוטידים המרכיבים את ה-DNA (או ה-RNA) את האלפבית בן 20 האותיות של חומצות אמינו המרכיבות חלבונים? מהי מהות הקוד הגנטי?

הרעיונות הראשונים לגבי קיומו של הקוד הגנטי נוסחו על ידי אלכסנדר דאונס ( 1952 ד.) וג'ורג'י גאמוב ( 1954 ז'). מדענים הראו שרצף הנוקלאוטידים חייב לכלול לפחות שלושה קישורים. מאוחר יותר הוכח שרצף כזה מורכב משלושה נוקלאוטידים, הנקראים קודון (שְׁלִישִׁיָה). עם זאת, השאלה אילו נוקלאוטידים אחראים לשילוב איזו חומצת אמינו במולקולת חלבון נותרה פתוחה עד 1961.

ובתוך 1961 מרשל נירנברג, יחד עם היינריך מאטיי, השתמשו במערכת לשידור בַּמַבחֵנָה. אוליגונוקלאוטיד שימש כתבנית. הוא הכיל רק שאריות אורציל, והפפטיד שסונתז ממנו כלל רק את חומצת האמינו פנילאלנין. לפיכך, המשמעות של הקודון נקבעה לראשונה: הקודון UUU מקודד לפנילאלנין. מאוחר יותר, הר קוראן מצא שרצף הנוקלאוטידים UCUCUCUCUCUC מקודד לקבוצה של חומצות אמינו סרין-לאוצין-סרין-לאוצין. בגדול, בזכות היצירות של נירנברג והקוראן, ל 1965 שנה, הקוד הגנטי נפרם לחלוטין. התברר שכל שלישיה מקודדת חומצת אמינו מסוימת. וסדר הקודונים קובע את סדר חומצות האמינו בחלבון.

העקרונות העיקריים של תפקודם של חלבונים וחומצות גרעין גובשו בתחילת שנות ה-70. נמצא שסינתזה של חלבונים וחומצות גרעין מתבצעת על פי מנגנון המטריצה. מולקולת התבנית נושאת מידע מקודד על רצף חומצות אמינו או נוקלאוטידים. במהלך שכפול או שעתוק, התבנית היא DNA, ובמהלך תרגום ותעתוק הפוך, היא mRNA.

כך נוצרו התנאים המוקדמים להיווצרות תחומי ביולוגיה מולקולרית, לרבות הנדסה גנטית. ובשנת 1972, פול ברג ועמיתיו פיתחו את הטכנולוגיה של שיבוט מולקולרי. מדענים השיגו את ה-DNA הרקומביננטי הראשון בַּמַבחֵנָה. תגליות יוצאות דופן אלו היוו את הבסיס לכיוון חדש בביולוגיה מולקולרית, ו 1972 השנה נחשבת מאז לתאריך הלידה של ההנדסה הגנטית.

3. שיטות ביולוגיה מולקולרית

התקדמות עצומה בחקר חומצות הגרעין, מבנה ה-DNA והביוסינתזה של חלבונים הביאו ליצירת מספר שיטות בעלות חשיבות רבה ברפואה, בחקלאות ובמדע בכלל.

לאחר לימוד הקוד הגנטי ואת העקרונות הבסיסיים של אחסון, העברה ויישום של מידע תורשתי, שיטות מיוחדות הפכו נחוצות להמשך הפיתוח של הביולוגיה המולקולרית. שיטות אלו יאפשרו לתמרן, לשנות ולבודד גנים.

הופעתן של שיטות כאלה התרחשה בשנות ה-70 וה-80. זה נתן תנופה עצומה לפיתוח הביולוגיה המולקולרית. קודם כל, שיטות אלו קשורות ישירות לייצור גנים והכנסתם לתאים של אורגניזמים אחרים, כמו גם לאפשרות לקבוע את רצף הנוקלאוטידים בגנים.

3.1. אלקטרופורזה של DNA

אלקטרופורזה של DNAהיא השיטה הבסיסית לעבודה עם DNA. אלקטרופורזה של DNA משמשת יחד עם כמעט כל השיטות האחרות כדי לבודד את המולקולות הרצויות ולנתח עוד יותר את התוצאות. שיטת האלקטרופורזה בג'ל עצמה משמשת להפרדת שברי DNA לפי אורך.

לפני או אחרי אלקטרופורזה, הג'ל מטופל בצבעים שיכולים להיקשר ל-DNA. הצבעים זורחים באור אולטרה סגול, וכתוצאה מכך נוצרת דפוס של פסים בג'ל. כדי לקבוע את אורך שברי ה-DNA, ניתן להשוות ביניהם סמנים- סטים של שברים באורכים סטנדרטיים, אשר מוחלים על אותו ג'ל.

חלבונים פלורסנטיים

כאשר חוקרים אורגניזמים אוקריוטיים, נוח להשתמש בחלבונים פלואורסצנטיים כגנים לסמן. הגן לחלבון הפלורסנט הירוק הראשון ( חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) מבודד ממדוזות אקיוריאה ויקטוריהולאחר מכן הוכנס לתוך אורגניזמים שונים. לאחר מכן בודדו גנים לחלבונים ניאון בצבעים אחרים: כחול, צהוב, אדום. כדי להשיג חלבונים בעלי תכונות של עניין, גנים כאלה שונו באופן מלאכותי.

באופן כללי, הכלים החשובים ביותר לעבודה עם מולקולת ה-DNA הם אנזימים המבצעים מספר טרנספורמציות של DNA בתאים: DNA פולימראז, ליגזות DNAו מגבלות (אנדונוקליזות הגבלה).

טרנסגנזה

טרנסגנזהזה נקרא העברה של גנים מאורגניזם אחד לאחר. אורגניזמים כאלה נקראים טרנסגני.

תכשירי חלבון רקומביננטי מתקבלים רק על ידי העברת גנים לתאי מיקרואורגניזם. רוב החלבונים האלה הם אינטרפרונים, אִינסוּלִין, כמה הורמוני חלבון, וכן חלבונים לייצור מספר חיסונים.

במקרים אחרים משתמשים בתרביות תאים של אוקריוטים או בעלי חיים מהונדסים, בעיקר בעלי חיים, שמפרישים את החלבונים הדרושים לחלב. בדרך זו מתקבלים נוגדנים, גורמי קרישת דם וחלבונים נוספים. שיטת הטרנסגנזה משמשת להשגת גידולים עמידים בפני מזיקים וקוטלי עשבים, ושפכים מטופלים בעזרת מיקרואורגניזמים מהונדסים.

בנוסף לכל האמור לעיל, טכנולוגיות טרנסגניות הן הכרחיות במחקר מדעי, מכיוון שפיתוח הביולוגיה מהיר יותר עם שימוש בשיטות שינוי והעברת גנים.

מגבלות

רצפים המוכרים על ידי אנזימי הגבלה הם סימטריים, ולכן כל סוג של הפסקות יכול להתרחש באמצע רצף כזה, או עם שינוי בגדיל אחד או בשניהם של מולקולת ה-DNA.

כאשר מפצלים כל DNA עם אנזים הגבלה, הרצפים בקצות המקטעים יהיו זהים. הם יוכלו להתחבר שוב כי יש להם אתרים משלימים.

אתה יכול לקבל מולקולה בודדת על ידי תפירת רצפים אלה באמצעות ליגזות DNA. בשל כך, ניתן לשלב קטעים של שני DNA שונים ולקבל DNA רקומביננטי.

3.2. PCR

השיטה מבוססת על יכולתם של פולימראזות DNA להשלים את הגדיל השני של ה-DNA לאורך הגדיל המשלים באותו אופן כמו בתהליך שכפול ה-DNA בתא.

3.3. רצף DNA

ההתפתחות המהירה של שיטת הרצף מאפשרת לקבוע ביעילות את מאפייני האורגניזם הנחקר ברמת הגנום שלו. היתרון העיקרי של טכנולוגיות גנומיות ופוסט-גנומיות כאלה הוא הגדלת אפשרויות המחקר והמחקר של האופי הגנטי של מחלות אנושיות על מנת לנקוט בצעדים הדרושים מראש ולהימנע ממחלות.

באמצעות מחקר רחב היקף, ניתן לקבל את הנתונים הדרושים על המאפיינים הגנטיים השונים של קבוצות שונות של אנשים, ובכך לפתח את שיטות הרפואה. בשל כך, זיהוי נטייה גנטית למחלות שונות פופולרי מאוד כיום.

שיטות דומות ישימות באופן נרחב כמעט בכל רחבי העולם, כולל ברוסיה. בשל ההתקדמות המדעית, ישנה הכנסת שיטות כאלה למחקר רפואי ולפרקטיקה רפואית בכלל.

4. ביוטכנולוגיה

ביוטכנולוגיה- דיסציפלינה החוקרת את אפשרויות השימוש באורגניזמים חיים או במערכותיהם לפתרון בעיות טכנולוגיות, וכן יצירת אורגניזמים חיים בעלי התכונות הרצויות באמצעות הנדסה גנטית. ביוטכנולוגיה מיישמת את שיטות הכימיה, המיקרוביולוגיה, הביוכימיה וכמובן הביולוגיה המולקולרית.

הכיוונים העיקריים של התפתחות הביוטכנולוגיה (עקרונות התהליכים הביוטכנולוגיים מוכנסים לייצור של כל התעשיות):

1. יצירה וייצור של סוגים חדשים של מזון ומזון לבעלי חיים.
2. השגת ולימוד זנים חדשים של מיקרואורגניזמים.
3. גידול זנים חדשים של צמחים, כמו גם יצירת אמצעים להגנה על צמחים מפני מחלות ומזיקים.
4. יישום שיטות ביוטכנולוגיה לצרכי האקולוגיה. שיטות ביוטכנולוגיה כאלה משמשות למיחזור פסולת, טיפול בשפכים, אוויר פליטה ותברואה בקרקע.
5. ייצור ויטמינים, הורמונים, אנזימים, סרומים לצרכי הרפואה. ביוטכנולוגים מפתחים תרופות משופרות שבעבר נחשבו חשוכות מרפא.

הישג מרכזי בביוטכנולוגיה הוא הנדסה גנטית.

הנדסה גנטית- מערך טכנולוגיות ושיטות להשגת מולקולות RNA ו-DNA רקומביננטיות, בידוד גנים בודדים מתאי, מניפולציה של גנים והחדרתם לאורגניזמים אחרים (חיידקים, שמרים, יונקים). אורגניזמים כאלה מסוגלים לייצר מוצרים סופיים עם המאפיינים הרצויים והמעודכנים.

שיטות הנדסה גנטית מכוונות לבניית שילובים חדשים, שלא היו קיימים בעבר, של גנים בטבע.

אם כבר מדברים על הישגי ההנדסה הגנטית, אי אפשר שלא לגעת בנושא השיבוט. שיבוטהיא אחת משיטות הביוטכנולוגיה המשמשות להשגת צאצאים זהים של אורגניזמים שונים באמצעות רבייה א-מינית.

במילים אחרות, ניתן לחשוב על שיבוט כתהליך של יצירת עותקים זהים מבחינה גנטית של אורגניזם או תא. ואורגניזמים משובטים דומים או זהים לחלוטין לא רק בתכונות חיצוניות, אלא גם בתוכן גנטי.

הכבשה הידועה לשמצה דולי בשנת 1966 הפכה ליונק המשובט הראשון. זה הושג על ידי השתלת גרעין של תא סומטי לתוך הציטופלזמה של הביצית. דולי הייתה העתק גנטי של הכבשה תורמת הגרעין. בתנאים טבעיים, פרט נוצר מביצית מופרית אחת, לאחר שקיבל מחצית מהחומר הגנטי משני הורים. עם זאת, במהלך השיבוט, החומר הגנטי נלקח מתא של פרט אחד. ראשית, הגרעין, המכיל את ה-DNA עצמו, הוסר מהזיגוטה. אחר כך הם הוציאו את הגרעין מתא הכבשה הבוגר והשתילו אותו לתוך הזיגוטה הזו ללא הגרעין, ואז הוא הושתל ברחם של מבוגר וניתן לו לגדול ולהתפתח.

עם זאת, לא כל ניסיונות השיבוט הצליחו. במקביל לשיבוט של דולי, בוצע ניסוי החלפת DNA ב-273 ביצים אחרות. אבל רק במקרה אחד חיה בוגרת חיה יכולה להתפתח ולגדול במלואה. אחרי דולי, מדענים ניסו לשבט סוגים אחרים של יונקים.

אחד מסוגי ההנדסה הגנטית הוא עריכת גנום.

הכלי CRISPR/Cas מבוסס על אלמנט של מערכת ההגנה החיסונית של חיידקים, אותו התאימו מדענים כדי להציג כל שינוי ב-DNA של בעלי חיים או צמחים.

CRISPR/Cas היא אחת השיטות הביוטכנולוגיות למניפולציה של גנים בודדים בתאים. ישנם יישומים רבים לטכנולוגיה זו. CRISPR/Cas מאפשר לחוקרים להבין את התפקוד של גנים שונים. כדי לעשות זאת, אתה רק צריך לחתוך את הגן הנחקר מה-DNA וללמוד אילו פונקציות של הגוף הושפעו.

כמה יישומים מעשייםמערכות:

1. חַקלָאוּת.באמצעות מערכות CRISPR/Cas, ניתן לשפר יבולים. כלומר, להפוך אותם לטעימים יותר ומזינים יותר, כמו גם עמידים בפני חום. אפשר להקנות לצמחים תכונות אחרות: למשל לגזור גן אלרגני מאגוזים (בוטנים או אגוזי לוז).
2. רפואה, מחלות תורשתיות.למדענים יש מטרה להשתמש ב-CRISPR/Cas כדי להסיר מוטציות מהגנום האנושי שעלולות לגרום למחלות, כגון אנמיה חרמשית וכו'. בתיאוריה, CRISPR/Cas יכול לעצור את התפתחות ה-HIV.
3. כונן גנים. CRISPR/Cas יכול לשנות לא רק את הגנום של חיה או צמח בודדים, אלא גם את מאגר הגנים של מין. מושג זה ידוע בשם "כונן גנים". כל אורגניזם חי מעביר מחצית מהגנים שלו לצאצאיו. אבל שימוש ב-CRISPR/Cas יכול להגדיל את הסיכוי להעברת גנים בעד 100%. זה חשוב על מנת שהתכונה הרצויה תתפשט מהר יותר בכל האוכלוסייה.

מדענים שוויצרים שיפרו ומודרניים באופן משמעותי את שיטת עריכת הגנום CRISPR/Cas, ובכך הרחיבו את יכולותיה. עם זאת, מדענים יכלו לשנות רק גן אחד בכל פעם באמצעות מערכת CRISPR/Cas. אבל כעת חוקרים ב-ETH ציריך פיתחו שיטה שיכולה לשנות בו זמנית 25 גנים בתא.

עבור הטכניקה העדכנית ביותר, מומחים השתמשו באנזים Cas12a. גנטיקאים שיבטו בהצלחה קופים בפעם הראשונה בהיסטוריה. "מכניקה פופולרית";

Nikolenko S. (2012). גנומיקה: הצהרת בעיות ושיטות רצף. "פוסט-מדע".

ביולוגיה מולקולרית,מדע שמציב למשימתו את הידע על טבען של תופעות חיים על ידי חקר אובייקטים ומערכות ביולוגיות ברמה המתקרבת לרמה המולקולרית, ובמקרים מסוימים מגיעים לגבול זה. המטרה הסופית במקרה זה היא לגלות כיצד ובאיזו מידה הביטויים האופייניים של החיים, כגון תורשה, רבייה של הסוג שלו, ביוסינתזה של חלבון, ריגוש, צמיחה והתפתחות, אחסון והעברת מידע, טרנספורמציות אנרגיה, ניידות וכו', נובעים מהמבנה, התכונות והאינטראקציה של מולקולות של חומרים בעלי חשיבות ביולוגית, בעיקר שתי הקבוצות העיקריות של ביו-פולימרים בעלי מולקולריות גבוהה - חלבונים וחומצות גרעין. מאפיין ייחודי של מ.ב. - חקר תופעות החיים על עצמים דוממים או כאלה המאופיינים בביטויים הפרימיטיביים ביותר של החיים. מדובר בתצורות ביולוגיות מרמת התא ומטה: אברונים תת-תאיים, כגון גרעיני תאים מבודדים, מיטוכונדריה, ריבוזומים, כרומוזומים, קרומי תאים; עוד - מערכות העומדות על גבול הטבע החי והדומם - וירוסים, כולל בקטריופאג'ים, וכלה במולקולות של המרכיבים החשובים ביותר של החומר החי - חומצות גרעין וחלבונים.

היסוד עליו התפתח מ' הונח על ידי מדעים כמו גנטיקה, ביוכימיה, פיזיולוגיה של תהליכים יסודיים ועוד. לפי מקורות התפתחותו, מ' ב. קשורה קשר בל יינתק לגנטיקה מולקולרית, שממשיכה להיות חלק חשוב ממנה

מאפיין ייחודי של מ.ב. הוא התלת מימד שלו. עיקרו של מ.ב. מ' פרוץ רואה זאת בפירוש פונקציות ביולוגיות במונחים של מבנה מולקולרי. מ.ב. שואפת לקבל תשובות לשאלה "איך", לדעת את מהות התפקיד וההשתתפות של כל מבנה המולקולה, ולשאלות "למה" ו"בשביל מה", לברר, מצד אחד, את הקשר בין תכונות המולקולה (שוב, בעיקר חלבונים וחומצות גרעין) לבין הפונקציות שהיא מבצעת, ומצד שני, תפקידן של פונקציות בודדות כאלה במכלול הביטויים הכולל של פעילות חיונית.

ההישגים החשובים ביותר של הביולוגיה המולקולרית.הנה רשימה רחוקה מלהיות מלאה של ההישגים הללו: חשיפת המבנה והמנגנון של התפקוד הביולוגי של ה-DNA, כל סוגי ה-RNA והריבוזומים, חשיפת הקוד הגנטי; גילוי של שעתוק הפוך, כלומר סינתזת DNA על תבנית RNA; חקר מנגנוני התפקוד של פיגמנטים נשימתיים; גילוי המבנה התלת מימדי ותפקידו התפקודי בפעולת האנזימים, עקרון סינתזת המטריצה ​​ומנגנוני הביוסינתזה של חלבונים; חשיפת מבנה הנגיפים ומנגנוני שכפולם, המבנה הראשוני ובחלקו המרחבי של הנוגדנים; בידוד של גנים בודדים, סינתזה כימית ולאחר מכן ביולוגית (אנזימטית), כולל אנושית, מחוץ לתא (במבחנה); העברת גנים מאורגניזם אחד לאחר, כולל לתוך תאים אנושיים; הפענוח המתקדם במהירות של המבנה הכימי של מספר הולך וגדל של חלבונים בודדים, בעיקר אנזימים, כמו גם חומצות גרעין; גילוי התופעות של "הרכבה עצמית" של כמה אובייקטים ביולוגיים בעלי מורכבות הולכת וגוברת, החל ממולקולות חומצת גרעין ומעבר לאנזימים מרובי רכיבים, וירוסים, ריבוזומים וכו'; הבהרת עקרונות אלוסטריים ואחרים של ויסות פונקציות ותהליכים ביולוגיים.

בעיות של ביולוגיה מולקולרית.יחד עם המשימות החשובות שצוינו היה מ. (הכרת חוקי ה"הכרה", הרכבה עצמית ואינטגרציה) כיוון ממשי של חיפוש מדעי לעתיד הקרוב הוא פיתוח שיטות המאפשרות פענוח המבנה, ולאחר מכן ארגון תלת מימדי, מרחבי של מולקולרי גבוה. חומצות גרעין. כל השיטות החשובות ביותר, שהשימוש בהן הבטיח את הופעתו והצלחתו של M. b., הוצעו ופותחו על ידי פיזיקאים (אולטרה-צנטריפוגה, ניתוח דיפרקציית רנטגן, מיקרוסקופיה אלקטרונית, תהודה מגנטית גרעינית וכו'). כמעט כל גישות הניסוי הפיזיקלי החדשות (לדוגמה, שימוש במחשבים, קרינת סינכרוטרון או ברמססטרהלונג, טכנולוגיית לייזר וכו') פותחות אפשרויות חדשות עבור מחקר מעמיקבעיות מ.ב. בין המשימות החשובות ביותר בעלות אופי מעשי, שהתשובה עליהן צפויה ממ' ב', מלכתחילה היא בעיית הבסיס המולקולרי של גידול ממאיר, ואז - דרכים למנוע, ואולי להתגבר על מחלות תורשתיות - " מחלות מולקולריות". חשיבות רבה תהיה בירור הבסיס המולקולרי של קטליזה ביולוגית, קרי, פעולת האנזימים. בין הכיוונים המודרניים החשובים ביותר של מ.ב. צריך לכלול את הרצון לפענח את מנגנוני הפעולה המולקולריים של הורמונים, חומרים רעילים ותרופתיים, וכן לברר את הפרטים של המבנה המולקולרי ותפקודם של מבנים תאיים כגון ממברנות ביולוגיות המעורבות בוויסות תהליכי החדירה והחדירה. הובלה של חומרים. שערים רחוקים יותר מ. ב. - הכרת טבעם של תהליכים עצביים, מנגנוני זיכרון וכו'. אחד הקטעים החשובים המתעוררים של M. b. - מה שנקרא. הנדסה גנטית, ששמה לה למשימתה את פעולתו התכליתית של המנגנון הגנטי (הגנום) של יצורים חיים, החל במיקרובים ומטה (חד-תאיים) וכלה בבני אדם (במקרה האחרון, בעיקר לצורך טיפול רדיקלי ב-. מחלות תורשתיות ותיקון פגמים גנטיים).

הכיוונים החשובים ביותר של ה-MB:

- גנטיקה מולקולרית - חקר הארגון המבני והתפקודי של המנגנון הגנטי של התא והמנגנון ליישום מידע תורשתי

– וירולוגיה מולקולרית – חקר המנגנונים המולקולריים של האינטראקציה של וירוסים עם תאים

– אימונולוגיה מולקולרית – חקר דפוסי התגובות החיסוניות של הגוף

- ביולוגיה מולקולרית של התפתחות - חקר המראה של מגוון תאים במהלך התפתחות אינדיבידואלית של אורגניזמים והתמקצעות של תאים

מטרות עיקריות של מחקר: וירוסים (כולל בקטריופאג'ים), תאים ומבנים תת-תאיים, מקרומולקולות, אורגניזמים רב-תאיים.

ביולוגיה מולקולרית / mə לɛ ליʊ לאה / הוא ענף בביולוגיה הנוגע לבסיס המולקולרי של פעילות ביולוגית בין ביומולקולות במערכות תאים שונות, לרבות אינטראקציות בין DNA, RNA, חלבונים והביוסינתזה שלהם, וויסות האינטראקציות הללו. הקלטה ב טֶבַעבשנת 1961, אסטברי תיאר את הביולוגיה המולקולרית:

לא כל כך טכניקה אלא גישה, גישה מנקודת המבט של מה שנקרא מדעי היסוד עם הרעיון המוביל של חיפוש מתחת לביטויים רחבי היקף של הביולוגיה הקלאסית אחר התוכנית המולקולרית המתאימה. זה עוסק, במיוחד, עם טפסיםמולקולות ביולוגיות ו... בעיקר תלת מימדיות ומבניות - מה שלא אומר, עם זאת, שזה רק חידוד של המורפולוגיה. הוא חייב במקביל לחקור את היצירה והתפקוד.

קשר למדעים ביולוגיים אחרים

חוקרים מתחום הביולוגיה המולקולרית משתמשים בשיטות הספציפיות של גידול ביולוגיה מולקולרית, אך יותר ויותר משלבים אותן עם שיטות ורעיונות מהגנטיקה והביוכימיה. אין קו מוגדר בין הדיסציפלינות הללו. זה מוצג בתרשים הבא, המתאר סוג אפשרי אחד של קשר בין שדות:

• בִּיוֹכִימִיָה הוא חקר כימיקלים ותהליכים חיוניים המתרחשים באורגניזמים חיים. ביוכימאים מתקשים להתמקד בתפקיד, בתפקוד ובמבנה של ביו-מולקולות. חקר הכימיה מאחורי תהליכים ביולוגיים וסינתזה של מולקולות פעילות ביולוגית הם דוגמאות לביוכימיה.
• גנטיקה הוא חקר ההשפעה של הבדלים גנטיים באורגניזמים. לעתים קרובות ניתן להסיק זאת על ידי היעדר מרכיב נורמלי (למשל גן בודד). חקר ה"מוטנטים" - אורגניזמים שיש להם מרכיב פונקציונלי אחד או יותר ביחס למה שנקרא "סוג פראי" או פנוטיפ נורמלי. אינטראקציות גנטיות (אפיסטאזיס) מבולבלות לעתים קרובות על ידי פרשנויות פשוטות של מחקרי "נוקאאוט" כאלה.
• ביולוגיה מולקולרית הוא חקר הבסיס המולקולרי של תהליכי שכפול, שעתוק, תרגום ותפקוד התא. הדוגמה המרכזית של הביולוגיה המולקולרית, שבה חומר גנטי מועתק ל-RNA ואז מתורגם לחלבון, למרות הפשטה יתרה, עדיין מספקת נקודת פתיחה טובה להבנת התחום. התמונה תוקנה לאור תפקידים חדשים המתפתחים עבור RNA.

שיטות של ביולוגיה מולקולרית

שיבוט מולקולרי

אחת הטכניקות הבסיסיות ביותר לביולוגיה מולקולרית לחקר תפקודו של חלבון היא שיבוט מולקולרי. בטכניקה זו, ה-DNA המקודד לחלבון המעניין משובט באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ו/או אנזימי הגבלה בפלסמיד (וקטור ביטוי). לוקטור יש 3 מאפיינים בולטים: מקור שכפול, אתר שיבוט מרובה (MCS), וסמן ניתן לבחירה, בדרך כלל עם עמידות לאנטיביוטיקה. אתר השיבוט המרובה במעלה הזרם הם אזורי המקדמים והתחלת התעתוק המווסתים את הביטוי של הגן המשובט. ניתן להחדיר פלסמיד זה לתאי חיידקים או בעלי חיים. הכנסת DNA לתוך תאים חיידקייםיכול להיעשות על ידי טרנספורמציה של קליטת DNA עירום, צימודים של תא לתא, או על ידי טרנסדוקציה עם וקטור ויראלי. החדרת ה-DNA לתאים אוקריוטיים, כגון תאים של בעלי חיים, באמצעים פיזיים או כימיים נקראת טרנספקציה. מספר שיטות טרנספקציה שונות זמינות, כגון טרנספקציה של סידן פוספט, אלקטרופורציה, הזרקת מיקרו והעברה ליפוזומלית. הפלסמיד עשוי להיות משולב בגנום, וכתוצאה מכך טרנספקציה יציבה, או יכול להישאר בלתי תלוי בגנום, המכונה טרנספקציה ארעית.

ה-DNA המקודד לחלבונים המעניינים נמצא כעת בתוך התא, וכעת ניתן לבטא את החלבונים. מערכות מגוונות, כגון פרומטורים הניתנים להשראה וגורמי איתות ספציפיים של תאים, עוזרות לבטא עניין בחלבון ברמות גבוהות. לאחר מכן ניתן להפיק כמויות גדולות של החלבון מהתא החיידקי או האוקריוטי. ניתן לבדוק את החלבון לפעילות אנזימטית במצבים שונים, ניתן לגבש את החלבון כדי לחקור את המבנה השלישוני שלו, או, בתעשיית התרופות, ניתן לחקור את פעילותן של תרופות חדשות נגד החלבון.

תגובת שרשרת פולימראז

ספיגת מקרומולקולות ולימוד

תנאים צְפוֹנִי , מַעֲרָבו מִזְרָחִיהספיגה יוצאת ממה שהיה במקור בדיחה של ביולוגיה מולקולרית ששיחקה על המונח דרום נט, בעקבות הטכניקה שתוארה על ידי אדווין סאות'רן להכלאת DNA BLOTTED. פטרישיה תומאס, מפתחת של בדיקת RNA, אשר נודעה אז בשם צפוני - סופג, למעשה אל תשתמש במונח.

סיכה דרומית

הנקרא על שם הממציא שלו, הביולוג אדווין סאות'רן, הכתם הדרומי הוא טכניקה לבחינת נוכחות של רצף DNA ספציפי בדגימת DNA. דגימות DNA לפני או אחרי עיכול אנזים הגבלה (אנזים הגבלה) מופרדות על ידי אלקטרופורזה של ג'ל ואז מועברות לממברנה על ידי ספיגת נימי דם. לאחר מכן, הממברנה נחשפת לבדיקת DNA מסומנת בעלת רצף בסיס משלים לזה שעל ה-DNA המעניין. במעבדה המדעית יש פחות שימוש נרחב ב-Soutting דרומית בגלל היכולת של שיטות אחרות, כמו PCR, לזהות רצפי DNA ספציפיים מדגימות DNA. כתמים אלה עדיין משמשים ליישומים מסוימים, עם זאת, כגון מדידת מספר העתקים טרנסגנים בעכברים מהונדסים או בקווי נוק-אאוט הנדסי של גנים של תאי גזע עובריים.

סיכה צפונית

תרשים כתם צפוני

סופג מזרח

מחקר קליני וטיפולים רפואיים הנובעים מביולוגיה מולקולרית מכוסים בחלקם על ידי ריפוי גנטי. היישום של גישות ביולוגיה מולקולרית או ביולוגיה מולקולרית של תאים ברפואה נקרא כיום רפואה מולקולרית. לביולוגיה מולקולרית יש גם תפקיד חשוב בהבנת היווצרותם, הפעולות והתקנות של חלקים שונים של תאים שניתן להשתמש בהם כדי למקד ביעילות תרופות חדשות, לאבחן מחלות ולהבין את הפיזיולוגיה של התא.

לקריאה נוספת

• Cohen, SN, Chang, NKD, Boyer, H. & Heling, RB בנייה של פלסמידים חיידקיים פונקציונליים ביולוגית בַּמַבחֵנָה .